创新工具助力解决抗生素抵抗

细菌对抗生素的耐药性是世界范围内的一个关键问题。新的解决方案有助于改变这种状况。

依赖细菌运动、基因组学和机器学习的诊断可能有助于解决全球危机。

2007 年，马萨诸塞州波士顿哈佛大学（Harvard University）的医生和生物信息学Maha Farhat花了几个月在南非德班的一家医院照顾病人。当地许多人感染了艾滋病毒。但是，当时让医生和病人担忧的感染不是由HIV病毒引起的，而是由一种细菌引起的：结核分枝杆菌，一种引起结核病的病原体。Farhat特别担忧的一点是，一些菌株对常规的抗生素有抗性。

尽管免疫功能低下的患者特别容易感染结核杆菌，但这种感染并不是 HIV 感染者独有的：2019年，结核分枝杆菌在全球夺走了 140 万人的生命，其中仅有208,000人是HIV患者。Farhat指出，结核病曾短暂地被COVID-19夺走“最致命感染”的行头，但它仍然是全球头号传染病杀手。耐药结核菌是造成这一问题的主要原因。

各种类型的耐药病原体引发了一场抗生素耐药性危机，威胁着公共卫生、农业、畜牧业等。但是发现这些菌株并确定有效的治疗方法很棘手。在资源有限的国家，很难找到能够处理传染性病原体（如结核分枝杆菌）的实验室，而用于测试药物敏感性的仪器可能需要几天才能返回结果。在许多情况下，医生仅在一种或多种标准抗生素失效后才进行耐药性测试。在等待期间，患者可能会接受一些不必要或无效的抗生素疗程，或者未经治疗就离开诊所。

Farhat等人正在转向使用原子力显微镜、基因组学和机器学习等工具来创建即时诊断测试，他们希望能在几分钟内提供结果，最大限度地减少使用不正确或不必要的处方。德国格赖夫斯瓦尔德大学医学中心（University Medical Center Greifswald）的临床微生物学家 Evgeny Idelevich表示，提高速度是最重要的进步。

评估细菌增殖

评估微生物药物敏感性的金标准方法是圆盘扩散试验。该方法可追溯到1889年，具体做法是：在琼脂平板上培养细菌，然后将装有药物的小纸盘放在正在生长的细胞上；如果药物杀死细菌或阻止其生长，圆盘周围的区域就会变得透明，这表明微生物对药物敏感。

药企已经在抗菌敏感性测试仪器中利用了相同的原理，例如总部位于新泽西州的BD Biosciences的BD Phoenix和总部位于法国 Marcy-l’Étoile的bioMérieux的VITEK 2。这些系统将细菌接种到含有抗生素的液体培养体系中，并寻找指示细菌生长或死亡的光学变化。测试通常需要4到8小时，但出结果可能需要一天或更长时间，因为临床医生必须将样本送到临床微生物实验室。

但研究人员也在开发与物理科学相关的分析，而不是微生物实验室。

例如，在2018年，Idelevich设计了一种基于MALDI-TOF的液体培养测试的小型化版本，这是一种质谱技术，使用激光诱导电离，离子通过长长的“飞行管”行进，并根据它们的质量和电荷识别分子。Idelevich等人将两种病原体（铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌）培养物的微滴直接放置在用于MALDI-TOF的固体支持基质上，并用不同的药物孵育每个液滴。然后，他们使用专为细菌鉴定设计的系统Bruker Daltonik 的 MALDI Biotyper来处理样本。特征光谱峰的强度表明培养物是否对抗生素敏感或耐药。

2013年，位于罗马的意大利国家研究委员会（National Research Council of Italy）的 Giovanni Longo等人发现，当他们将致病性大肠杆菌附着在名为悬臂的微型跳水板状结构上时，因为活细菌的微小运动，悬臂会上下摆动。如果微生物对抗生素敏感，则运动停止。在原子力显微镜下几分钟内就可以看到这种运动——早在微生物复制之前——这意味着该测试可以比寻找细菌生长的分析方法更快地识别活细菌。

伦敦大学学院（University College London）的纳米技术研究员 Rachel McKendry和她当时的研究生Isabel Bennett想将这种方法引入诊所。但是将细菌附着在培养皿中200微米长的悬臂上说起来容易做起来难。Bennett指出，只有一小部分悬臂会附着细菌，有时细菌会结块，有时附着太少。

当她与Longo的团队合作对过程进行微调时，Bennett检测到反射光的巨大差异，这表明即使微生物没有附着在悬臂上，也可以发现类似的细菌运动。因此，该团队改变了策略：他们改变了设置，以跟踪漂浮在结构表面上的细菌。他们用坚硬的反光材料制成悬臂，并开发了分析细菌运动的软件，以便读数与溶液中的细菌数量成正比。McKendry指出，与当前方法相比，这种看似简单的信号确实是一种检测耐药性的好方法。

Bennett 建议，虽然尚未商业化，但该系统可以适应和扩大用于临床使用。反射面可以制成插入物，放置在常规使用的微量滴定板中，原子力显微镜被DVD播放器的光学阅读器取代以捕获信号。她表示，这可能是一个非常简单、低成本的设置。

马萨诸塞州波士顿大学（Boston University）的物理学家 Kamil Ekinci 正在研究细菌抗生素耐药性的另一个指标：电流。他的团队将掺有肺炎克雷伯菌（尿路感染的常见原因）的尿液样本直接放入含有抗生素的微流体装置的单个通道中，并通过通道追踪电导。Ekinci指出，如果细菌生长并堵塞通道，它们就会产生更大的电阻，她们基本上是将细菌的生长转化为电信号。

Ekinci补充，优势在于电信号比显微镜图像更容易放大和可视化。原则上，我们的技术可以检测单个细菌分裂，尽管该方法可能不适用于所有细菌，尤其是生长缓慢的病原体，如结核分枝杆菌。

测量分子标记

基于细菌生长的测试简单、便宜且非特异性：单一测试适用于广泛的病原体。但是，在哥本哈根Rigshospitalet研究医学微生物学的Susanne Häussler指出，由于测试结果取决于生长条件和使用正确浓度的抗生素，这些都是不利条件。

作为替代方案，Häussler等人正在转向基因组学以寻找耐药性的线索。哈佛大学的流行病学家Sophia Koo指出，这种“无需培养的测试”是该领域的下一个重大转变。

加州斯坦福大学（Stanford University）传染病研究员 Gary Schoolnik表示，依赖与抗生素抗性机制明显相关的基因是更快诊断的理想途径，因为它不需要长时间的细菌孵化。但重要的是要知道细菌基因组中的哪些序列对耐药性很重要，亚利桑那州凤凰城梅奥诊所（Mayo Clinic）的临床微生物学家Thomas Grys认为，如果你不这样做，你很容易错过一个新机制或检测到一个实际上没有赋予抗性的基因片段。

Schoolnik还是Visby Medical的首席医疗官，这是一家总部位于加利福尼亚的初创公司，在 2020年美国国立卫生研究院（US National Institutes of Health）和美国卫生与公众服务部生物医学高级研究与发展局（US Department of Health and Human Services’ Biomedical Advanced Research and Development Authority）赞助的抗微生物药物耐药性诊断挑战赛中，该机构获得了1900万美金的赞助。

该公司的测试是一次性使用的即时诊断，使用简单的手持设备运行，以发现淋病奈瑟氏菌等性传播病原体的耐药性。该测定侧重于赋予环丙沙星耐药性的突变，环丙沙星是一种常用于治疗淋球菌感染的口服抗生素。编码促旋酶A的基因的突变说明了对环丙沙星耐药或敏感的奈瑟菌菌株之间的差异。

用于检测此类变异、基于PCR的测试在诊所中的用途有限，原因是PCR反应需要设备、试剂和训练有素的实验人员。Visby的诊断通过将检测简化成颜色变化来绕过这些限制。扩增的片段流入设备上的一个腔室，该腔室包含针对每个基因变体的捕获探针。结合导致颜色变化，反映菌株对环丙沙星是敏感还是耐药。

其他人继续探索全基因组测序，以捕获赋予抗性的变异谱。但基于这些信息，开发低成本、快速的测试仍然是一个挑战。英国伯明翰大学（University of Birmingham）研究基因组学机器学习方法的数据科学家Nicole Wheeler表示，这不仅与抗性基因的存在有关，还与它的表达有关。收集的转录组学和蛋白质组学数据越多，就越有可能提高预测耐药性的能力。

仅基于基因组测序的技术对某些病原体（例如肠道沙门氏菌）效果很好，但在其它病原体（包括铜绿假单胞菌）中，多个调控基因的突变可以改变基因表达模式（从而改变耐药性）。Häussler指出，原则上，所有转录组数据都在基因组中，但有时查看转录组比寻找所有可能改变基因表达的突变更容易。

例如，2014年，日本大阪理化学研究所（RIkagaku KENkyusho/Institute of Physical and Chemical Research，RIKEN）的生物工程师 Chikara Furusawa 研究了在不同抗生素存在下适应生长的大肠杆菌实验室菌株。他发现，相比于利用基因组DNA的信息，利用基因表达的变化能更准确地预测耐药性。基因表达和抗性之间的相关性显著高于基因组标记和抗性之间的相关性。

纸盘扩散测试是揭示抗生素有效性的常用方法。

预测未来的抗药性

在他们的工作中，Häussler等人将基因组和转录组标记的组合作为预测铜绿假单胞菌抗生素耐药性的最佳“标志”。

但是为了改进他们的模型，他们转向了机器学习。他们不是简单地识别产生抗性的突变，而是使用他们的算法来识别预测菌株对抗生素抗性的DNA和RNA变异的特征。 Häussler指出，该算法仅有助于识别关键特征——它不会成为最终诊断测试的一部分。尽管如此，Wheeler表示，这种方法可以克服仅通过基因组捕获耐药性的局限性。

这些算法不仅可以简单地将病原体当前的耐药情况告知临床医生，还可以揭示一种菌株可能会因治疗而产生哪些抗生素耐药机制。尽管如此，Wheeler认为，决定一个算法是否应该被信任仍然具有挑战性，它们是黑匣子。例如，即使您拥有所有代码和所有数据，您也不一定知道是什么促使模型说样本A对阿奇霉素具有抗药性。

开发人员正在努力克服的另一个问题是过度拟合，Wheeler表示，算法可能会“记住数据中的大量不重要的特征”，而不是学会找到真正的相关性。由于细菌基因序列可能非常相似，机器学习工具可能会过度简化问题并得出错误的结论。Wheeler将这个问题比作有缺陷的图像搜索：一种在田间农场动物的许多照片上训练的算法可能会将一张开放空间的照片识别为一只羊。细菌经常在不属于其基因组的圆形DNA小块上相互传递抗生素抗性基因。但由于基因组的其余部分是相同的，算法可能会说该菌株仍然敏感，我们真正需要的是让这些模型去学习抗性生物学。

鉴于研究和测试结核细菌的限制，Farhat采用了一种机器学习方法，该方法使用全基因组序列进行预测。4月，他的团队描述了一种名为GenTB的基于网络的工具，该工具可以预测对几种结核病药物的耐药性。该工具的性能因输入序列数据的质量和相关药物而异。Farhat 指出，虽然一个常见的突变导致对用于结核病的一线药物的耐药性高达80%，但几种罕见的变异对二线药物的耐药性产生了小幅增强。有时，只有当存在几个这样的突变时，结果才会显示有抗性。

工作正在进行中

无论使用哪种方法，研究人员都面临着相同的基本挑战：设计一种能显著改善当前设备的诊断方法。Grys指出，目前的测试已经可以在不到24小时内将结果返回给临床医生，每次测试只需一两美元。问题不在于测试是否好，而是它比我们现在拥有的更好吗？重要的是要设定一条有助于我们实现目标的轨迹。

一些开发中的测试在他们可以处理的样本种类，或者他们可以测试的细菌或抗生素方面受到限制。例如，Visby的诊断目前仅限于淋球菌感染，而Ekinci的微流体装置需要尿液样本，无法处理由一种以上细菌引起的感染。其他需要先进显微镜或光谱仪的设备，例如悬臂梁，需要进行调整，然后才能供在世界各地资源匮乏的诊所里工作的非专家使用。生物梅里埃微大学（bioMérieux University）生物学研究主管Alex van Belkum指出，因为其中许多方法是针对少数药物测试一种或两种微生物，所以它们只征服了“冰山一角”。这些技术与目前实验室中的自动抗生素敏感性测试系统之间仍然存在很大的差距。

McKendry指出，正如在COVID-19大流行中——在此期间，快速检测被证明对检测和阻止病毒传播至关重要——低成本、即时诊断对于减少抗生素的滥用至关重要。抗菌素耐药性是一个非常复杂的问题，新的测试只是解决方案的一部分。

原文检索：
Jyoti Madhusoodanan. (2021) Innovative tools take aim at antibiotic-resistant microbes. Nature, 596:611-613. 
张洁/编