寻找红色荧光蛋白之旅
通过开发红色荧光蛋白，生物工程师正在扩展生物成像的工具箱和渗透深度。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是显微镜专家工具箱中最受欢迎的工具之一。这是一项获得诺贝尔奖的创新，它出色地照亮了各种生物领域、实验室和技术中人们感兴趣的分子。但在物理化学家Julie Biteen的眼中，GFP并没有优势。
Biteen在密歇根大学（University of Michigan）安娜堡分校研究肠道细菌群落，并渴望使用荧光蛋白来识别复杂混合物中的单个物种。但是肠道细菌不喜欢氧气——GFP绝对需要的，没有氧气，就没有绿色荧光。
于是，她使用了一个可以不用氧气的标签。IFP2.0是荧光蛋白工具箱的一个相对较新的补充，主要在近红外波段发出荧光——这是电磁光谱的一部分，人眼几乎看不到，但显微镜相机很容易看到。Biteen等人真的很兴奋，因为他们可以看到单个细胞并识别它们。
红色荧光成像还具有其它优势：较低的背景荧光、较低的毒性和更深的组织成像深度。一半时间在东京大学（University of Tokyo）工作，另一半时间在加拿大埃德蒙顿的阿尔伯塔大学（University of Alberta）工作的蛋白质工程师Robert Campbell指出，在其它因素相同的情况下，荧光越红越好（波长越长越好）。并且，红色荧光蛋白（red fluorescence protein, RFP）的发现，诞生了一种可以在实验中增加1种或2种颜色荧光的方法。马萨诸塞州波士顿哈佛医学院（Harvard Medical School）的显微镜专家 Talley Lambert表示，一个实验中可以观测到的通道越多，且没有明显的信号干扰，我们可以研究的相互作用就越多。
RFP已经存在了几十年了，但它们在亮度和色调方面仍然普遍无法与GFP匹敌。甚至RFP也更接近橙色。科学家们在开发真正红色的荧光蛋白方面取得了进展——通常称为“远红色”，以区别于早期的尝试。远红色荧光具有类似的优势。远红色荧光的开发仍处于起步阶段，但生物勘探、蛋白质工程和合成化学方面的进步正在帮助改进标签。目前大多数RFP都以基因形式存储在质粒库 Addgene 中。
学界对RFP有很大的需求。科学家们迫切需要能够与由绿光和蓝光激活的标准工具（例如 GFP、蓝色DNA染色剂和通道视紫红质）一起使用的标签和传感器。位于加利福尼亚州卡尔斯巴德的 Thermo Fisher Scientific 产品管理高级经理 Brian Almond 表示，替代色调通常是客户对新荧光工具的第一个要求。客户告诉他，现在荧光都是绿色的，我们需要其它颜色的荧光蛋白。
猩红溶液
典型的荧光显微镜实验可以使用大约三种颜色，而不会重叠。但是挑选可以协同工作的荧光标签并不像选择黄、绿和蓝那么简单。目前有数百种荧光蛋白可供选择，它们的色调、亮度和荧光寿命等因素各不相同。有些是单一单位的蛋白质，但其它蛋白有可能相互粘连，甚至可能将感兴趣的蛋白质粘合到其它类似的蛋白质上，从而干扰结果。最优荧光蛋白因项目而异。
渥太华大学（University of Ottawa）蛋白质工程师 Roberto Chica 提醒，在选择标签时，最好不要过于依赖已发表的数据。在试管中运行良好的蛋白质在模式生物中可能不会发光，并且数据表通常不完整。最好是在实验中测试几种荧光蛋白，然后从中挑一个。
一些免费的在线资源可以帮助科学家选择候选荧光蛋白，包括 Lambert的FPbase；Thermo Fisher的荧光光谱查看器（Fluorescence SpectraViewer）；以及由加利福尼亚州圣地亚哥的 BioLegend开发的荧光光谱分析器（Fluorescence Spectra Analyzer）。用户可以查看数百种荧光蛋白和染料的激发和发射曲线，并通过输入他们的光源、过滤器和检测器，进行相应的选择。
使用多种颜色的一种策略是让计算机在收集数据后整理出任何重叠的发射光谱。 BioLegend 产品经理 Kenta Yamamoto指出，通过这种“光谱成像和线性分离”或“荧光分离”的技术，研究人员可以探测更多的颜色组合——在同一个流式细胞术实验中多达40个标签。但是这种颜色组合需要仔细规划，例如，如果有多种荧光标签夹杂在一起，稀有蛋白质可能需要搭配更亮的标签。
一种更简单的方法是使用不与任何其它颜色发射光谱重叠的颜色。这就是远红和近红外标签的用武之地；它们可以很容易地从相同的细胞中获得至少四个不重叠的信号。在他位于中国杭州西湖大学的实验室中，工具开发人员Kiryl Piatkevich使用三种可见颜色和近红外范围内的两种颜色，定期记录来自同一张显微镜载玻片的五个信号。此类实验通常无需重大设备升级即可进行。
荧光蛋白来源
虽然在海洋生物中发现了许多荧光蛋白，但远红和近红外荧光蛋白往往来自细菌。但与GFP 和类似蛋白质不同，细菌光受体缺乏吸收光的成分（即发色团）。它们需要添加一种名为胆绿素的色素。好消息是胆绿素是血红素分解的天然中间体，它与氧气结合以将其输送到血液中，因此它天然存在于哺乳动物中。坏消息是胆绿素很快会被降解，因此体内含量远远不够。
该问题的一种解决方案是添加更多胆绿素，要么额外添加标准化学品，要么通过改变生物体来制造更多胆绿素。阿尔伯特爱因斯坦医学院（Albert Einstein College of Medicine）的分子生物工程师Vladislav Verkhusha表示，另一种方法是设计天然远红和近红外蛋白质，以便它们在宿主体外更好地工作，例如通过提高蛋白质和色素之间的结合效率。他的团队在体外诱导相关基因的随机突变，然后在大肠杆菌中表达这些基因并选择最红或最亮的产物。在一个实验中，该团队使用了17轮这种分子进化方法来获得一种称为miRFP670nano的近红外蛋白质标签。该标签约为GFP大小的 60%，可有效结合胆绿素并在哺乳动物细胞中发出明亮的荧光。
Piatkevich 也使用分子进化方法，但在哺乳动物细胞中，折叠蛋白质使其与目标细胞的蛋白质相匹配，而不是在细菌中进行蛋白进化。他的团队使用这种方法增强了近红外荧光电压报告器（用于跟踪神经细胞放电）的亮度，从而创建了一种名为Archon的传感器。
还有一种方法是直接设计蛋白质。哈佛医学院（Harvard Medical School）的合成生物学家Timothy Wannier 在帕萨迪纳加州理工学院（California Institute of Technology）攻读博士学位期间，对 GFP家族分子使用了分子进化和基于计算机的蛋白质分析和设计。他的目标是将二聚体远红荧光蛋白转化为单体，这将有助于防止不良相互作用。但他还必须设计突变以稳定孤立的单体。
其中一个标签mKelly1引起了阿尔伯塔大学（University of Alberta）蛋白质工程师Yi Shen的注意，他用它来构建名为FR-GECOs的远红钙传感器。
没有最红，只有更红
尽管取得了这些进展，远红和近红外荧光蛋白产生的亮度仍然不够。一些绿色蛋白质突破了亮度极限，但最好的近红外标签亮度仅为GFP最亮值的10-20%左右。
一种解决方案是基于远红和近红外化学染料的变通方法，这些染料也越来越广泛可用。弗吉尼亚州阿什本霍华德休斯医学研究所珍利亚研究园区（Howard Hughes Medical Institute Janelia Research Campus）的有机化学家 Luke Lavis 开发了一种明亮、无毒的染料，可以根据周围环境在无色和荧光形式之间切换。此后，Lavis与蛋白质工程师同事 Eric Schreiter 合作，将这些染料转变为“化学遗传”细胞传感器，将化学染料与蛋白质伙伴结合。
他们使用基因编码的“HaloTag”作为合成染料的底座，并将其连接到在钙或电压存在的情况下改变形状的传感器蛋白。Schreiter表示，形状变化改变了染料的局部环境，使其发出荧光——并且比以前的红色传感器明亮约十倍。Lavis免费将染料提供给其他科学家。他现在正在测试下一代染料，他预计这些染料将深入组织以进行体内应用。
Schreiter认为，这类传感器的未来是光明的，应该可以用 HaloTag替换任何现有传感器中的 GFP，以创建新的红色化学遗传传感器。但对于其它荧光标签，Lavis表示，标准的荧光蛋白应该够用了，因为它们非常好用。
原文检索：
Amber Dance. (2021) The hunt for red fluorescent proteins. Nature, 596: 152-153.
张洁/编译
