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shRNA表达克隆

新技术突破大样本成像分辨率极限

Dec 03, 2019 No Comments

光片成像技术使用低强度激光在更长的时间内对活体组织进行成像。

光片成像技术使用低强度激光在更长的时间内对活体组织进行成像。

 

显微镜的一个问题是,样品越大,分辨率越低。研究者通过对小鼠大脑的分子细节进行成像,获得了一些过去无法得到的信息。

在位于弗吉尼亚州阿什伯恩的霍华德休斯医学院珍妮亚研究所(Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus)三楼一间阳光充足的办公室里,Philipp Keller正兴冲冲地展示她最新显微镜的光学元件。它们看起来平平无奇。

Keller指着他的电脑屏幕表示,这个系统里面都是这个,就是这些玻璃板,就像从连续流炉(continuous-flow furnace)里取出来的一连串玻璃板。

这些玻璃板看起来像书本大小的冰块,就像站在图书馆的书架上一样。物理学家Keller希望用它们来建造一种新型显微镜,这种显微镜可以达到高分辨率,并且可以处理生物学家梦寐以求的大尺寸标本。

Keller指出,在生物显微镜技术中,研究人员要么在低分辨率下观察大样本,要么在高分辨率下观察小样本。要观察比一立方毫米还大的大样本,并从中找出细胞或更细微的细节是不可能的。

Keller提醒,这通常是一种取舍,你可以得到一个宏观的视图,也可以得到一个高分辨率的微观视图。而将两者结合起来的唯一方法就是采取某种大规模的平铺策略,你只需要一个很小的成像体积,然后就可以在整个3D样本中对它进行栅格化处理,然后拼接起来——这是一个既耗时又需要计算的过程。

越来越多的研究人员正在开发“mesoscopes”——“mesoscopes”显微镜——以规避这一挑战。这些仪器可以捕获超过1 cm大小的样本中的细胞,甚至亚细胞。最后的数据集提供了一个前所未有的视角。正如英国格拉斯哥斯特拉斯克莱德大学(University of Strathclyde)的光学物理学家Gail McConnell所言,这几乎是微距摄影,但分辨率更高。

例如,为了遵循快速移动的过程,研究人员通常会在短时间里连续捕捉多个图像。因此,样品必须非常明亮,以便在可用时间内提供尽可能多的光子。这需要输入更多的光能,但这又会杀死(或至少漂白)样品。因此,这样的成像通常不能长时间进行。

 

大尺寸样本

类似地,能够捕捉精细细胞细节的系统往往视野狭窄。点扫描共聚焦显微镜通过使用高度聚焦的一束激光对样本进行扫描,在样品上逐点激发荧光,从而产生亚细胞结构的清晰图像。

McConnell认为,这样的成像对于非常小的组织体积来说效果非常好,但它不能应用于大的样本——例如晚期小鼠胚胎——因为低放大率透镜的数值孔径很小,而这对于如此大的样本来说是必须的。数值孔径(numerical aperture, NA)是指透镜捕捉光线的能力;较高的NA通常对应于较高的放大率和较短的物镜和样品之间的工作距离。

为了解决这个问题,McConnell与斯特拉斯克莱德大学(University of Strathclyde)的共聚焦显微镜开发人员Brad Amos合作,用高钠和低放大率的不同寻常的组合构建了一个宏观尺度的物镜,它能够提供广阔的视野和高空间细节。其结果是“mesolens”显微镜,一种定制的光学系统,可以在6 mm宽的视野范围内成像,横向分辨率为0.7 μm,轴向分辨率为5 μm,工作距离为3 mm,足以分辨直径约为典型哺乳动物细胞十分之一的物体。

McConnell指出,这些“mesolens”显微镜看起来就像肥胖版的物镜,它的长度和宽度和成年人的手臂差不多。McConnell的团队花了十年来建造这个“mesolens”显微镜,它的玻璃元件几乎是普通显微镜物镜直径的三倍,这使得它与许多现成的组件不兼容。她还表示,与传统镜片相比,它们需要承受高强度的打磨和抛光,——更不用提它们之间的对齐了——比普通镜片要严格得多。

合适的探测器也是个问题。McConnell提醒,McConnell和Amos花了这么长时间才造出“mesolens”显微镜的一个原因是他们必须等待能够捕捉到光子的大视场传感器。Amos与人共同创立了一家将mesolens商业化的附属公司,但目前他们还没有真正进入商业领域(他没有持有公司的股份)。他们正在研究一种镜片处方,希望它能更容易生产。

尽管如此,McConnell的团队已经开始用它的设计来解决生物学上的问题,包括细菌生物膜的结构。细菌生物膜是一种微生物的集合,它们生长在其分泌的薄膜的表面,通常与疾病有关。McConnell指出,她们正在观察这些生物膜的新特性,它们可能为她们应对抗菌素耐药性提供潜在的知识。

清华大学信息科学家戴琼海也一直致力于解决厘米级样本的成像问题。该实验室的一位物理学家孔令杰指出,意识到高分辨率显微镜技术与功能性磁共振成像和计算机断层扫描等宏观尺度技术之间存在巨大差距后,戴的团队开始着手开发一种高时空分辨率的十亿像素显微镜。

这项工作的成果是RUSH,一种拥有自定义物镜、由35个摄像机组成的曲面阵列以及能够实时捕获和分析数据的计算系统的仪器。孔指出,尽管“mesolens”显微镜每秒可以产生大约400万像素的数据,但RUSH每秒可以产生51亿像素,以每秒30帧的速度对10×12 mm2的视野进行成像。这足以在一张照片中显示出小鼠大脑的整个表面,也足以分辨出被称为线粒体的单个亚细胞细胞器。

戴博士的研究小组利用该系统跟踪小鼠大脑表面的荧光标记血细胞,并监测新制备的人脑切片的神经活动。该团队目前正在计划对非人类灵长类动物进行研究。孔表示,他们正在开发具有更高分辨率和数据吞吐量的第二代RUSH及其商业版本,预计明年上市。

 

“魔镜、魔镜”

为了应对大样本的挑战,Keller的团队从天文学中得到了启示。大型望远镜之所以使用镜片,是因为它们比透镜更轻,更容易制作。当镜头变大时,镜片也不会发生像差。那么为什么没有人用它们来制造显微镜呢?

Keller的团队对定制显微镜并不陌生。在过去十年中,人们已经开发了一系列越来越复杂的“光片”系统,该系统使用低强度激光平面对样品进行投射。从侧面(即与光平面成90度)捕捉图像,以最大限度地延长成像时间并减少光损伤。在Keller实验室的小房间里,这些显微镜被安装在光学工作台上。它们可以记录果蝇和斑马鱼发育过程中的细胞动力学和神经活动,一次可以记录几个小时。

2018年10月,Keller领导的研究小组的科学家Kate McDole介绍了一种显微镜和环境实验室的组合设计,将这段时间延长到了两天。她把它用在一个更具挑战性的课题上:与一套功能强大的自定义分析软件相结合,McDole便能够在48 h内对小鼠胚胎中的每个细胞进行成像和跟踪。在此期间,胚胎的体积增长了250倍。

定制显微镜提供了非凡的灵活性,但不一定容易使用。McDole估计十个实验中只有七个能完成。有时是显微镜出问题,有时是样品出问题。有时,维持动物生长所需的二氧化碳罐会被关闭,有时显微镜的计算机系统会在实验过程中进行更新——这种情况并不少见。McDole自嘲,墨菲定律“像小狗”一样跟着她。

该实验室由光学工程师Dan Flickinger和博士后Benquan Wang负责,正在开发的“镜式显微镜”项目的关键元件是一个长度为168 mm的凹面镜。Keller指出,制作这个凹面镜的成本约为6,000美元。该系统拥有14×14 mm2的视野,NA值高达1.0,以及一组由12个摄像头组成的检测阵列,该系统应该可以捕获比大多数商业显微镜尺寸大200倍的样品,即便如此,该显微镜仍然可以分辨亚细胞的细节。

与Janelia的另一个团队合作,Keller希望使用基于镜片的系统来捕捉整个老鼠大脑的神经连接,或“连接体”。他希望同时记录几条斑马鱼在小碟子里相互作用和游泳时的大脑活动。Keller指出,数据集可以达到pb级——相当于他的团队目前一年产生的数据量。McDole的第一个小鼠数据集是20tb,并且它破坏了她们所有的成像软件。

然而,首先,团队必须证明设计是有效的。初步测试定于本月启动。Keller有信心,到今年年底,他们将有第一张完全基于镜式显微镜的探测系统的图像。

 

双光子系统

光学显微镜最适合于相对透明的样品。更不透明的标本需要其它技术,研究人员也在将它们应用于大范围的视野方面取得了进展。

2016年,由瑞士苏黎世大学(Fritjof Helmchen)的显微镜开发人员Fritjof Helmchen、北卡罗莱纳大学教堂山分校(University of North Carolina, Chapel Hill)的Spencer Smith和珍妮亚研究所的Karel Svoboda领导的团队分别描述了创新的“双光子”显微镜,该显微镜可以对宏观尺度的样本进行成像。这些设备只能在一个清晰的平面上使用超高速、长波长的激光脉冲激发样品中的荧光。尽管这样得到的图像对比度高,深度可达1 mm,但仅覆盖约1 mm2。Svoboda的系统,被称为2p-RAM “mesolens”显微镜,则提供了一个5×5 mm2的视野——足够观察整个小鼠大脑的表面。Helmchen和Smith的系统图像的视野分别为1.8×1.8 mm2和9.5 mm2以上。

这个2p-RAM的仪器的视野(橙色)可以一次对小鼠大脑的大部分区域进行成像。
这个2p-RAM的仪器的视野(橙色)可以一次对小鼠大脑的大部分区域进行成像。

 

Svoboda指出,当目标变大时,仅仅把目标放大是不够的,多个部分必须重新设计,以适应光在该系统中的传播。事实上,他的团队之所以选择5×5 mm2的视野,是因为当时还没有更大的探测器。5 mm2是当时的检测极限,除非你愿意舍弃一些信号。而在这个行业,人们讨厌这样做。

这样的系统让神经科学家能见森林,也能见树木。Svoboda表示,试图通过一次只研究一个大脑区域来解码神经交流,就像专注于乐队的一个部分。随着视野的扩大,小鼠皮层表面的一大块区域开始接受仔细检查。神经元像灰色的颗粒状萤火虫一样闪烁,通过追踪这些闪烁的时间,研究人员可以确定细胞、回路和更大的大脑区域之间的相关性。他们现在可以实时查询他们所说的多区域回路或多区域交互。

该2p-RAM系统已授权给弗吉尼亚州斯特林的显微镜供应商Thorlabs。哈佛大学(Harvard University)的神经科学家Mackenzie Mathis购买了首批商用仪器之一。上个月,在伊利诺斯州芝加哥召开的神经科学学会年会上,Mathis向Thorlabs的一个用户组会议展示了一些数据,这些数据表明,她可以利用这个系统,加上一些自制的深度学习软件,来研究与视频游戏互动的小鼠。

2p-RAM中的RAM的意思是“随机访问mesoscopy”(random-access mesoscopy):该系统可以在整个视野内快速移动激光。Mathis指出,这在实践中意味着,我可以进入运动皮层,记录第5层的输出神经元,然后进入另一个皮层区域,同时成像2/3层。这些数据可以揭示大脑区域在小鼠玩游戏时是如何相互作用和交流的。

但是2p-RAM不能同时扫描这些区域,当激光从一个地方跳到另一个地方时,会有几毫秒的延迟。Helmchen和Smith的设计使用了分束器来有效地同时成像多个点——这个过程称为时间复用。Smith和神经科学家Jerry Chen( Helmchen论文的第一作者,现在就职于马萨诸塞州的波士顿大学(Boston University))正在合作开发第二代系统,他们介绍指出该系统将能够在一个2p-RAM大小的视野范围内同时访问四个区域。Thorlabs公司的总经理Sam Rubin表示,该公司已经在各个实验室安装了超过25个“mesolens”显微镜,目前正在开发一种能够在多个深度同时成像的升级版系统。

 

斜射光

在纽约市哥伦比亚大学(Columbia University)的生物医学工程师Elizabeth Hillman找到了一种方法,将光学显微镜应用到不透明的样品上。在传统的薄层显微镜中,激光束由其自身垂直于探测目标的物镜聚焦。这种安排限制了该系统所能容纳的样本的大小,并妨碍了它在活小鼠身上的应用。

Hillman的设计被称为SCAPE 2.0,其工作过程是:消除其中一个目标,将一束光斜射到样品中,并使用相同的镜头捕捉产生的荧光。唯一可移动的元件是一个转向镜,当与快速相机配合使用时,该系统可以以惊人的速度记录体积。Hillman表示,他们可以比点扫描显微镜更快地完成三维成像。

但是光片仍然不能很好地穿透不透明的样品。因此,Hillman现在正在开发一种双光子变体,它将能够探测数百微米的不透明样品,以及更大样品的mesoscale版本。

该系统还可以应用于另一个快速发展的显微镜领域:通过化学处理使其透明化的大型组织(如小鼠大脑)的成像。Hillman的研究小组在短短4 min内便拍摄到了一块8.4×9.1×0.4 mm3的小鼠大脑图像。一些其它光片成像系统也可以处理这样的样品。其中一种被称为mesoSPIM,可以对21 mm的视野进行成像;另一种方法是由位于达拉斯的得克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center)的物理学家Reto Fiolka和他的同事们开发的,他们将毫米大小的视野拼接在一起,用亚细胞分辨率对厘米大小的样本进行成像。Keller实验室的校友、哥伦比亚大学Hillman实验室的同事、神经科学家Raju Tomer又开发出了另一种几何结构,名为“光板显微镜”。这种设计提供了1 mm的视野,但理论上可以容纳任何宽度的样品。

随着这些设计和其它设计在显微镜界的渗透,新的研究途径将会开启。但是,Keller提醒,要想产生真正广泛的影响,显微镜技术的发展必须与更好的样品制备和处理、易用性和可负担性相结合。如果目标是在高分辨率下对一个大样本进行成像,显微镜能做的非常有限。

 

 

原文检索:
Jeffrey M. Perkel. (2019) The microscope makers putting ever-larger biological samples under the spotlight. Nature, 575:715-717.
张洁/编译

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