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废弃DNA助力生态学研究

Jul 02, 2019 No Comments

废弃DNA助力生态学研究1

无脊椎动物,如婆罗洲虎水蛭(haemadipsa picta)拥有可用于监测其它动物的环境DNA。

 

生态学家正在利用野生动物身上携带的DNA监测生物多样性。

Kristine Bohmann于2010年访问了伊斯瓦蒂尼王国,目的是去收集蝙蝠粪便。她可不是什么鸟粪爱好者,只是希望能证明蝙蝠是益虫,会吃农作物害虫,以说服甘蔗农民保护蝙蝠的栖息地。通常情况下,她需要在显微镜下仔细检查蝙蝠粪便,以找到,并识别昆虫遗骸。但是,当回到哥本哈根大学(University of Copenhagen)时,Bohmann有了一个全新的计划。

这个计划是为了识别蝙蝠粪便中存在的物种——不是通过显微镜,而是通过遗传分析识别。 Bohmann的研究表明,对蝙蝠粪便中的昆虫DNA进行测序可以揭示蝙蝠的食谱。

生态学家现在越来越依赖动物投放到环境中的DNA,即所谓的环境DNA (environmental DNA, eDNA)。这些科学家并不是徒步进入野外数周或数月来收集和分类识别生物,而是利用生物脱落的皮肤细胞、鱼鳞、尿液、粪便、血液和唾液等物质了解稀有、濒危和入侵物种的细节,以及衡量生物多样性。

早期的eDNA研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)来扩增来自个体物种的DNA。但是较新的技术,例如Bohmann使用的技术,可以在同一样本中靶向一系列物种的DNA。最新的方法完全绕过PCR,使用DNA测序来检测生物体特征。

这些技术使eDNA研究在其范围内变得更具创新性和雄心勃勃,允许科学家对交大的地理区域中的一系列群体进行分类研究。但在估算物种丰度时,该技术仍然存在困难,需要昂贵的实验室设备和复杂的生物信息学分析。尽管研究eDNA的技术非常先进,但生态学家仍然需要在室外放置设备以收集样本。但随着eDNA研究变得越来越便宜和越来越容易获得,它将越来越成为传统野外生物技术的有力补充。

生态学家对于eDNA研究的热情也很高。丹麦奥胡斯大学(Aarhus University)的分子生态学家Philip Francis Thomsen表示,生物多样性在全球范围内受到巨大威胁,我们实际上甚至没有足够的专家去记录现有的物种。我们需要知道还有哪些物种是存在的,而环境DNA可能是一种有效的记录方式。

 

样本收集

生态学和保护生物学的一大重点是知道哪个物种在哪里。为了调查在美国东南部被称为hellbenders(Cryptobranchus alleganiensis)的隐居蝾螈,野生动物生态学家Stephen Spear不得不浮潜或穿过小溪,抬起大块岩石,在下面寻找可能的样本。他一天之内最多可以调查两、三个附近的地点。不过,eDNA意味着他可以搜索更多的点——他只需要在河流和河流的不同点收集一升水。The Wilds(俄亥俄州坎伯兰的一个非营利性野生动物园和保护中心)负责人Spear指出,如果一个地方能拿到eDNA样本,也许你需要在该地点附近深入搜寻。

不用翻动石头也会减少身体损伤的风险。Spear回忆,之前有一次石头砸到了他的胳膊上,他的同事也曾经被岩石砸碎了骨头。

澳大利亚悉尼大学(University of Sydney)的进化生物学家Mark de Bruyn表示,不仅生态学家受益,eDNA对生物多样性非常有益,因为我们不需要杀死任何生物便可研究它。De Bruyn在博士学习期间前往东南亚旅行了六个月,收集了一小撮淡水虾。现在,他在英国班戈大学(Bangor University)的博士生Alice Evans只需要收集水样。de Bruyn在每个地点需要花上一周或更长时间,而Evans在一两天内就可以完成一个地点样本的收集,在一个区域只需要待上不到1个月便可完成任务。

 

从一个物种到多个物种

使用PCR扩增物种特异性DNA是监测个体入侵或濒危物种的相对简单的方法。但是更新的技术使Evans等生态学家能够同时从许多不同的分类群中获取数据——在Evans的项目中,他可以从一份样本中分析来自哺乳动物、鱼类、甲壳类动物和两栖动物的数据。早在2010年,Bohmann就面临着需要从蝙蝠粪便样本中识别出数十种昆虫的问题。幸运的是,她的顾问,哥本哈根大学(University of Copenhagen)的Thomas Gilbert刚刚开发出一种可以提供帮助的技术。

在eDNA宏条形码(DNA metabarcoding)中,科学家使用名为引物的、一端具有独特标签,且是一个物种所共有的短DNA片段进行PCR扩增,得到DNA。在Bohmann的案例中,她使用引物来对100多个粪便样本中的昆虫DNA片段进行平行扩增和测序,然后根据它们的独特标签进行区分。

这些数据可以提供区域生物多样性的广泛概述。Thomsen指出,一般来说,eDNA捕获的物种比生态学专家自己找到的还要多。他的eDNA宏条形码研究详细介绍了丹麦和格陵兰岛沿岸的鱼群,以及卡塔尔附近鲸鲨(Rhincodon typus)的遗传数据。Thomsen认为,目前还没有其它方法能得到这么广泛的数据,你甚至可以从分类树中获取(从细菌到鲸鱼)的信息。

位于英国艾格镇的eDNA分析服务提供商NatureMetrics的联合创始人兼总经理Kat Bruce表示,eDNA的检测也可能比传统方法更便宜。她表示,北海一个风力发电场附近的一项小型研究涉及三个水样,耗资600英镑(750美元),确定的鱼类种类达到了一个为期2年、耗资15万英镑的项目所记录的种类的三分之二。

此外,任何人都可以收集eDNA样本,从而为生态学做贡献。在一项对英国濒危大凤头蝾螈(Triturus cristatus)的调查中,公众成员收集的池塘水样的eDNA分析正确地确定了239个站点中的219个是大凤头蝾螈的栖息地。鉴于志愿者都没有接受过任何培训,研究人员建议,即使是极少的培训也可以减少假阴性率。

研究人员正在与亚马逊的生态旅游公司建立类似的项目。游客在访问国家公园时会收集eDNA样本,从而有助于长期的生物多样性监测。英国诺里奇东英吉利大学(University of East Anglia)的分子生态学家Douglas Yu指出,公众的参与有助于打破需要专家观察员的瓶颈,并可以研究更大的区域。

 

创意抽样

研究人员可以通过花、水蛭到空气等不断扩大的样品来源来研究地理区域。Bohmann表示,可以检测到动物和植物痕迹的样本类型多到无法想象。

在今年发表的一项研究中,Thomsen从丹麦两个草原地点采集的野花中提取了eDNA,并检测了100多种昆虫和其它接触过它们的节肢动物,包括传粉者、捕食者和寄生虫。以前,他不得不花一整天在花朵旁观察和识别与之相互作用的昆虫物种。Yu等人曾经为了收集熊的eDNA,在阿拉斯加跟踪一只棕熊(Ursus arctos)为她的两个孩子捕捉鲑鱼。当熊完成对一条鱼的咀嚼时,他们趁机收集食物残渣中的棕熊口水。

Yu表示,他们当时简直吓坏了,以为自己会死得很惨,虽然死得光荣。幸运的是,研究人员没有受到伤害,并拿到了新鲜的熊DNA。他们可以使用eDNA来实际识别个体熊,然后可以由此对棕熊进行计数。

Yu和其他人也依靠从无脊椎动物身上收集的DNA,这些无脊椎动物包括吸血的蚊子、以朽烂的动物尸体或粪便为食的苍蝇,以及从海水中过滤eDNA的海绵。为了调查中国一个偏远的、大小几乎与新加坡相当的自然保护区,Yu要求公园管理员在2016年的雨季收集水蛭。大约160名护林员围捕了大约3万条水蛭,这些水蛭携带了包含来自蝾螈、青蛙、哺乳动物和鸟类的eDNA。Yu指出,水蛭似乎相当于热带地区的-80°C冰柜。

 

测序挑战

Thomsen表示,eDNA非常实用,野生动物生态学家不必担心会失业。例如,我们仍然需要分类学专家建立参考数据库,eDNA得到的数据可以与之匹配以识别物种。Bruce指出,目前,我们发现的亚马逊鱼类中只有大约15%是已知物种。

在估计种群大小方面,eDNA逊色于常规生态技术(例如标记和重新捕获)。在标记和重新捕获方法中,种群中的个体被捕获、标记和释放,随后再次捕获时会被计数。在定量PCR和宏条形码方法中,扩增的DNA不一定反映其在环境中的丰度,并因此难以将PCR结果转化为群体估计。基于DNA测序的策略需要良好的参考数据库,因为eDNA样本充满了微生物DNA。

Spear指出,污染可能是处理微量DNA时面临的最大挑战。在不同地点进行操作时,研究人员必须一丝不苟地换手套、靴子或潜水服。进行eDNA提取和PCR扩增的房间必须是彼此分离且洁净的,处理DNA时必须带手套、口罩和无RNA实验服,以防止污染样本。

商业eDNA实验室可以提供帮助。秘鲁保护组织世界自然基金会(World Wide Fund for Nature or World Wildlife Fund)的生态学家José Luis Mena和Hiromi Yagui于2015年在法国生物技术公司Spygen合作开展了一项试点eDNA项目,以调查秘鲁亚马逊西南部的哺乳动物。此后,科学家在NatureMetrics的帮助下,对秘鲁亚马逊西北部的淡水脊椎动物进行了大规模的调查。

Yagui指出,他们把样本送到NatureMetrics等人那边,NatureMetrics等人给Yagui等人提供结果——一个物种及其数量的清单。eDNA样本特别适用于检测海牛等物种,这些物种难以通过其它野外方法识别。

尽管研究人员使用了其它几种已有技术,包括声纳和摄像机陷阱,但eDNA对它们来说是全新的。Mena指出,一开始他们对eDNA持怀疑态度,但第一批结果非常好,特别是因为eDNA与其它技术还具有互补性。不过每个样品花费约200英镑,这个过程并不便宜。研究人员还必须耐心等待结果,这可能需要数周,甚至更长时间才能进行更复杂的分析。

 

没有实验室?不成问题

使用更新的工具,研究人员可以越来越多地立即获得该领域的成果。在他的鲵鱼eDNA研究中,Spear使用了two3——一款来自宾夕法尼亚州费城Biomeme公司基于智能手机的便携式qPCR机器。虽然典型的qPCR机器一次可以检测96个样本,但是这两个机器一次只能检测3个(新一代产品,Franklin系列机器,最多可以一次检测9个)。但是,检测结果在几分钟之内可以出来,而不需要等待好几天,并且具有相当的准确性。Spear表示,如果你需要很快知道一个物种是否存在,这种系统可能非常有用。

但在现场使用便携式仪器可能是一项挑战。密苏里州堪萨斯城非盈利性合同研究机构MRI Global的微生物基因组学家Joseph Russell使用便携式测序仪监测佛罗里达州大沼泽地国家公园(Everglades National Park)内蚊子和蜱等节肢动物传播的病毒,并指出,这样做实际上是出于后勤困难和紧张的原因。一方面风和室外条件会影响样品管和试剂,并且几小时的测序会很快消耗完笔记本电脑的电量。

因此,Russell创建了手提箱大小的Mercury Lab,这是一个便携式实验室,包含一个工作台、冷却器、离心机、集成计算机和足够的功率,可以在远程现场连续几周轻松地运行便携式qPCR和测序实验。Russell表示,如果你只是带着充满数据的U盘回来,事情会变得简单很多。

这与Bohmann在2011年发表的蝙蝠eDNA研究时的预期相去甚远。Bohmann本以为没什么人会对这种研究感兴趣,他没想到自己开辟了一个全新的领域。


原文检索:
Sandeep Ravindran. (2019) Turning discarded DNA into ecology gold. Nature, 543 -545.
张洁/编译 

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