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shRNA表达克隆

医疗黑科技之微流体芯片

Jun 05, 2017 No Comments

医疗黑科技之微流体芯片图中芯片由Fluidigm公司开发,它可被用于微流体系统,以分析单个细胞样本中的基因组信息。

 

内设复杂通道的微流体装置有望简便高效地诊断遗传疾病。

加利福尼亚大学洛杉矶分校(University of California, Los Angeles)Dino Di Carlo实验室的生物工程师们长时间穿着从头裹到脚的清洁服,待在洁净室里。洁净室里的空气已经经过过滤,以确保无颗粒存在。在这间洁净室里,工程师们努力地改进一种感光材料。该材料在蓝色或紫色光照射下,会变硬。因此,房间里的照明是奶黄色灯光。

除了他们,医疗芯片领域的很多实验室也在开发新工具,以用于准备和分析血液和其它流体样本,诊断遗传异常,如癌细胞携带的突变。一般来说,这类分析工具都不需要在洁净室内开发,但微流体芯片需要液体穿过非常狭窄的通道。这种通道狭窄得即便是一粒尘埃,都有可能令其堵塞。因此,开发这类工具需要在洁净室内进行。理论上,这套被封装在载玻片大小的芯片上的检测技术可以快速自动地进行诊断工作:放入样本,输出结果;而且该操作非常简单,即便新手都可以操作。但实际上,这套装置通常不是这样运作的,在检测之前,我们必须对样本进行预处理。

Di Carlo等研究人员正在努力克服这些缺点,以使芯片更容易被制造出来,便于试验。他们正在解决的问题包括:小空间内预测液体的行为、降低芯片成本,同时提高检测效率。日本冲绳科学技术大学院大学(Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University)的化学工程师Amy Shen指出,解决这些问题需要跨学科合作。多学科合作开发医疗芯片,有助于减少开发时间和开发成本,从而加速遗传和传染病的诊断。

微流控回路使科学家能够处理珍贵或有限供应的样品,利用较少的试剂,得到更多的结果。分析微量样本,意味着可以并行地检测多个样本,并且速度很快。因为只有机器才能操纵这么小的体积,所以微流体有利于自动化,从而减少人为误差。理想情况下,即使没经过培训的技术员也可使用这种技术。

但目前距离实现这个目标还很遥远。迄今为止,开发人员都重点关注用于分析血液和其它体液中的DNA或RNA的微型化过程,例如通过创建微型化的聚合酶链式反应(PCR)机器来复制和定量稀有基因序列,或采用荧光探针进行核酸杂交实验。因此,微芯片方法通常需要对生物材料进行预处理,例如去除会干扰反应的成分。法国国家科学研究院(Centre national de la recherche scientifique)研究总监、微流体公司Fluigent的科学创始人Jean-Louis Viovy表示,目前主要的瓶颈是“试图扩大微流体工具箱,以便在无需预处理的情况下,直接分析检测样本。

 

诊断疾病

Di Carlo的实验室开发出了一款特定样品制备方法——分离循环肿瘤细胞(circulating tumour cells, CTC)。该方法可以揭示肿瘤起源和携带的突变的血液标志物。为了生产芯片,实验室使用一种名为光刻技术的常用技术,使用透明橡胶制造芯片。在洁净室中,工程师将液体混合物放在硅片圆形板上——一种用于生产计算机微芯片的材料。然后,模仿半导体工业,使用黑色“光掩模”覆盖聚合物。紧接着,他们用紫外光照射通道部分。这一部分液体固化,去除未曝光区域的光刻胶,从而形成芯片的负性光刻。

随后,Di Carlo实验室的工程师搬到正常的实验室。他们将液体PDMS倒在负性光刻铸件上,并在65℃下烘烤,以使PDMS硬化。最后,他们将玻璃片融入到PDMS的底部,创建了一个具有果冻外观的芯片原型。整个过程大约需要一天。

Di Carlo表示,一旦他们确定了哪个设计有效,就会采用与制造塑料玩具相同的工艺制造塑料芯片。

大多数微芯片制造技术得到的都是二维的设计。但某些情况下,3D结构才有用。在一个芯片设计中,Di Carlo使用一个磁场将液体从狭窄的通道引导到另一个更宽、更高的通道里。当流体进入较大的通道,会开始膨胀,表面张力会使其形成一个球体,也就是液滴。Di Carlo指出,这就像是纳米级的移液器,靠手工是无法完成这个过程的。这种划分使液体在芯片中变成多个小液滴,可以同时进行很多测试。

为了制作3D芯片,科学家通常不得不将连续的聚合物层叠在光刻模具中。但是3D打印改变了这一现状,因为它既不需要专业知识,也不需要太多的设备,仅入门级别的设计师就能够使用这一技术。荷兰瓦赫宁根大学(Wageningen University)的化学家Vittorio Saggiomo在家突然想到一个点子。此前他用3D打印技术打印了很多塑料工具,如小灯或移液器支架,以及一些有趣的小玩意儿,如鸟舍。直到某一天,他为了打磨表面,把3D打印的“星球大战”头盔浸入丙酮里,但浸泡时间太长,以致于头盔溶解了。他意识到他可以以同样的方式来打印微型通道。

Saggiomo和他的同事、化学家Aldrik Velders改进了这一技术,以在实验室合成芯片。他们使用3D打印机创建他们所需通道的形状,并将该塑料浸泡在PDMS中。然后将其放入丙酮中浸泡过夜,溶解塑料,留下的部分就是微芯片。Saggiomo和Velders利用这个技术制造交错复杂的通道。例如,他们设计了一个由弯曲通道包围的直线通道的芯片。 Saggiomo表示,用户可以在弯道内加入热或冷的液体,从而改变样品的温度(例如,PCR反应需要复杂的温度控制)。

即使采用标准制造程序,芯片设计师也越来越有创意,诸如使用人字纹、角和曲线等通道布局。Di Carlo指出,虽然该领域正在开始制定标准化设计,但流体通道的设计可变性还是很大的。

芯片设计师也在努力预测该层面的流体动力学。巴黎微流体公司Elvesys创新中心的工程师Walter Minnella表示,微流体的基础物理学与常规大体积的水完全不同。微流体层面上,一些力(如重力)变得可以忽略不计,而高表面积与体积比会增加表面张力,并且流体和通道壁之间的相互作用也变得非常重要。Di Carlo认为,微流体的水溶液变得粘稠,与蜂蜜相似,但没有波浪。因此,流体运动是可以预测的——但是,Di Carlo估计,这种预测仍然可能需要超级计算机花费一两天来解决,反复模拟是不切实际的。因此大多数科学家仍然选择使用一种经验性的方法,即构建、测试和重复(见“芯片小知识”)。

 

 

芯片小知识

医疗黑科技之微流体芯片2

Vortex芯片中形成的液滴通道。

 

构建微流体芯片的第一步往往是使用AutoCAD、Adobe Illustrator或SolidWorks等软件。加州大学洛杉矶分校(University of California, Los Angeles)生物工程师Dino Di Carlo指出,他们通过软件来设计芯片上的管道。微通道中的流体流动是可以预测的。但是预测需要大量运算,这要靠超级计算机才能完成。大多数研究人员更愿意迭代地设计芯片,即进入设计芯片—测试—根据测试结果调整设计—再测试的循环,直到达到他们预期的液体行为。软件在其中也起到一定作用。法国国家科学研究院的学者、Fluigent微流体公司科学创始人Jean-Louis Viovy表示,Fluigent可以提供软件工具来帮助研究人员调整芯片设计。

Di Carlo的团队建立了液体行为模拟工具uFlow。他们意识到微流体芯片通常包括重复元素,例如分割液体的S曲线或柱,因此在使用超级计算机来分析时,以每类设计元素为单元,研究其对液体行为的影响。同时,uFlow把每一个元素的终端输出,作为下一个元素的起始输入,从而在模拟复杂通道形状的同时节省处理能力。

一旦研究人员找到了理想的芯片设计,他们便可以自己生产,或订购定制芯片。马萨诸塞总医院(Massachusetts General Hospital)的Shannon Stott等人与Stratec旗下的日本电子巨头Sony公司签订合同,使用索尼公司生产蓝光光盘的机器来制造血液分选芯片。

还有标准的微流体芯片可用于执行常用功能。有很多供应商提供这种芯片:比较热门的选择包括安捷伦科技公司(Agilent Technologies)、英国Dolomite of Royston公司,以及本文中提到的Fluidigm和Fluigent公司。

 

 


血液分选

马萨诸塞州总医院(Massachusetts General Hospital)的机械工程师Shannon Stott和她的团队在确认最终设计之前,先后建立了一个芯片的多次迭代。他们的芯片主要用于液体活检——一种基于血液的遗传线索检测和诊断疾病的方法。他们的目标是建立一个可从微创血液样本中净化和分析循环肿瘤细胞的系统。他们把这个设计称为CTC-iChip ——i代表inertial focusing,惯性聚焦,将细胞按特定路线前往准确的位置,这样它们便能在与流体壁相撞时被均匀地拉伸(见“芯片解剖”)。除此之外,该芯片使得团队能够对患者血液样本中的循环肿瘤细胞进行计数,并研究其遗传组成。

CTC-iChip由塑料制成,它将三个步骤整合到一个设备中。第一阶段,芯片剔除了不必要的血液成分。科学家们用磁珠标记白血球,然后将液体通过包含一系列塑料柱的腔室。较小的物质,如红细胞和蛋白质会自如地穿梭在柱子“森林”中。更大的细胞,如白细胞和稀有的循环肿瘤细胞会在森林里跌跌撞撞。当它们与腔室壁碰撞发生反弹后,就会进入第二阶段,即S弯道或“摆动器”,细胞会在这里排成行。第三阶段,该设备使用磁铁分离出白细胞,留下循环肿瘤细胞。

 

医疗黑科技之微流体芯片3

Di Carlo的实验室使用一些点缀在侧边的通道,开发了分选血液样品的微流体方法。他的前学生SJ Claire Hur(现在就职于约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University))注意到更大的细胞被困在由微流体通道扩大而形成的旋涡中,这就像叶子和垃圾在河流中的弯曲或岩石中积累一样。该团队设计了一个由Vortex Biosciences公司生产的系统,并利用该系统分离CTC,以进行进一步分析。在一项临床试验中,研究人员利用该芯片检测循环肿瘤细胞上的生物标志物,以此检测肿瘤对特定免疫疗法的响应。

该系统不仅包括Vortex芯片,还包括外部管道和促进样本进入系统的泵,以及回收纯化的CTC馏分收集器。整个设备比微波炉稍微大一些,这使得它不像一个集成在芯片上的实验室(lab-on-a-chip),更像是实验室中的芯片(chip-in-a-lab)。

Di Carlo表示,一般来说,chip-in-a-lab就够用了。它仍然比常规方法节省资金,并通过减少实验者误差来提高输出。但是,一个真正的芯片实验室可以为发展中国家的诊所或现场站点提供快速的基因检测,因为在这些地方采购和运行PCR机器或离心机来分离血液样本可能是不切实际的。

 

移动实验室

工程师们提出了各种可能的解决方案。例如,一些工程师在开发廉价的纸制设备,以放大和检测血液样本中感染性微生物的基因。德国Hain Lifescience公司已经设计了可以检测特定DNA序列的条带测试。有些工程师则可以通过检测APOE基因是否存在突变,来评估个体患阿尔茨海默病的风险。其他工程师还可以报告与强直性脊柱炎(会影响脊柱)相关的基因。

密歇根州立大学(Michigan State University)环境工程师Syed Hashsham正在开发一种基于芯片的癌症和传染病领域遗传诊断装置。他认为,我们必须简化一切。为了降低生产成本,使芯片可现场密封,他抛弃了现场条件下难以密封的硅基芯片,换成了使用激光切割,并可用膜密封的塑料芯片。

另一个挑战是如何在现场检测出足够多的稀有遗传物质。标准方法,如PCR需要反复加热和冷却样品到精确的温度。但是,正如Hashsham所说的那样,要设计一款可以在这些温度之间准确切换的小型廉价便携式机器并非易事。在这种情况下,热循环根本无法实现。

鉴于此,Hashsham转而采用了另一种序列扩增方法。他使用自己开发的手持式微流体“Gene-Z”来识别和定量已知序列,如指示癌症的微小RNA或感染性生物体的基因。该芯片采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)技术,同时采用的是一种不同于PCR的酶,该酶不需要温度循环。研究人员将体液样品(例如痰)与荧光染料混合,随后将其混入反应中制备好的DNA中,接着使用注射器将其注入到通向16个单独腔室的通道中。值得注意的是,他们已提前往腔室中加入DNA扩增试剂、使其干燥,以备反应。反应完成后,设备使用发光二极管和传感器来检测染料(指示阳性反应)。

Hashsham表示,整个设备只有iPod Touch那么大,成本不超过200美元。每块一次性芯片包括64个室,可以检测共计四个样品,成本不到一美元。他验证了Gene-Z对100多种疾病的检测结果。他指出,现在的挑战是说服资助者制造不会立即获利的设备,因为他希望将其部署在诸如非洲等地区。因为在这些地区,快速诊断可以改变医学实践,挽救生命。

把想法转化为商业实践非常困难,这一点Shen十分赞同。她指出,如果成本太贵,或者不符合现有的制造流程,那么大公司就可能不会去设计。这使得微流体从实验室走向临床可能需要很长时间。虽然差距的确存在,但是S很认为她们正在慢慢弥合这一差距。最终他们肯定会成功的。

 

 

原文检索:
Amber Dance. (2017) The making of a medical microchip. Nature, 545(1038): 511-514.
张洁/编译

 

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