细胞的秘密生活，新技术可视化细胞内部

冷冻电子断层扫描和相关技术可以以惊人的细节可视化细胞内部。

现代显微镜方法，如冷冻电子断层扫描仪，为观察细胞内部打开了一扇窗。

在2017年的几个星期里，瑞士伯尔尼大学（University of Bern）的生物化学家Wanda Kukulski发现自己在看一种不寻常的电影：细胞内部的视频。它们是使用一种名为冷冻电子断层扫描 (cyro-electron tomography, cryo-ET) 的技术制成的，该技术使研究人员能够高分辨率地查看细胞中的蛋白质。在这些视频中，她可以以前所未有的细节看到各种引人注目的结构，例如细胞的内部运作和细胞内部的隔间。据Kukulski回忆，他被它的美丽和复杂所震撼，以至于晚上他就像看纪录片一样看它们。

近年来，像cryo-ET这样的成像技术让科学家们能够在生物分子的原生环境中观察它们。与将单个蛋白质从细胞中取出来研究它们的旧方法不同，这些技术提供了蛋白质和其他分子以及细胞景观的整体视图。尽管它们仍然存在局限性——例如，一些研究人员说，cryo-ET 的分辨率太低，无法确定分子的身份——但这些技术越来越受欢迎，且愈发复杂化。求助于它们的研究人员不仅被美丽的图像迷住了，而且还被正在揭示的一些秘密所震撼——例如细菌用来感染细胞的技巧或突变的蛋白质如何驱动神经退行性疾病，如帕金森氏症。

帕萨迪纳市加州理工学院（California Institute of Technology）的结构生物学家Grant Jensen表示，通过显微镜的每一次窥视都是探索未知细胞领域的又一次机会。能够第一次看到一些东西肯定是一种极大的乐趣。

其他研究人员也为此激动不已。加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的生物物理学家Elizabeth Villa 回忆起她第一次用冷冻电镜看到细胞结构时的激动之情。 Villa表示，感觉好像突然之间，他们变成了狗仔队，获得了前所未有的访问权限。

从晶体到原生环境

几十年来，研究人员一直依靠一种称为X射线晶体学的技术来可视化蛋白质、病毒和其他生物实体。该方法包括诱导分子形成静态、有序的晶体，然后用强X射线束轰击样品。它使人们能够发现DNA的螺旋性质和超过100,000种蛋白质的结构，但它有其局限性：分子结晶的过程既困难又无聊，而且并不总是可行的。

科学家们使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）克服了这些缺点，该技术揭示了从周围环境中分离出来然后冷冻的生物分子的结构。在冷冻电镜中，样品被电子束轰击。尽管该技术最初由于图像模糊，被嘲笑为“blobology”（英文讽刺，一团轮廓的技术），但样品制备和图像处理的进步已将其分辨率提高到足以可视化单个原子（大约1.2埃或1.2×10^_–10 m大小）。

随着这场“分辨率革命”开始席卷冷冻电镜，大约在2013年，科学家们纷纷开始使用这种方法。到目前为止，研究人员已经用它解决了10,000多个生物分子的结构。特别是在细胞膜中发现的蛋白质引起了人们的兴趣，因为它们中的许多对于了解疾病和开发药物很重要。 Jensen指出，这一进展“为一些真正有才华的人打开了大门，然后他们可以寻找下一个最富有、最成熟的领域，以实现具有重大影响的进展”。该区域恰好是cryo-ET。

它的早期支持者希望，使用这种技术不仅可以精细地观察生物分子，还可以观察细胞内部。与cryo-EM一样，cryo-ET需要电子显微镜，并依赖于一种名为玻璃化的样品制备方法：样品周围的水快速冷却，使其冻结成玻璃状状态，而不是冰晶。然而，与需要纯化样品的传统冷冻EM不同，研究人员可以使用冷冻ET原位捕获这些分子。

使用冷冻电镜，科学家通过拍摄大量不同角度的孤立分子的2D图片并合并结果来制作3D 图像。相比之下，使用cryo-ET，他们可以从许多不同的角度拍摄一块充满分子的单一材料的多个快照，从而使周围环境保持完整。

这就像拥有一张全人群的照片，而不是一个人的头像。这就是为什么该技术的先驱之一、德国马丁斯里德马克斯普朗克生物化学研究所（Max Planck Institute of Biochemistry）的生物物理学家 Wolfgang Baumeister等人将其称为“分子社会学”的原因。

毕竟，这就是蛋白质的生存方式。Villa表示，蛋白质是社会性的——在任何给定时间，一种蛋白质与大约十种其他蛋白质形成复合物。在看到与冷冻ET的这种相互作用后，Villa无法忍受自己单独研究一种蛋白质的想法。

电子断层扫描本身——使用电子显微镜从多个角度对样本进行成像——自1960年代就已经存在，但直到1990年代，该方法才开始出现。挑战之一是电子流对生物样本具有极大的破坏性，这使得很难捕获足够的快照以获得清晰的图像。科学家们使用最新的样本切片过程和计算方法锐化了他们的照片。例如，一种称为低温聚焦离子束（cryo-focused-ion-beam, cryo-FIB）的技术可以将样品切割成极薄的薄片。Baumeister提醒，尽管如此，使用冷冻ET 所需的成本和技能——特别是与冷冻FIB研磨等方法结合使用——可能让许多实验室望而却步。

Baumeister小组的早期冷冻ET演示包括网基网柄菌细胞的快照，这是一种生活在土壤中的大量细菌变形虫。除其他外，该团队还揭示了构成变形虫细胞骨架的复杂蛋白质网络的前所未见特征——例如单个细丝如何相互作用并附着在网基网柄菌细胞膜上的特定结构上。

Baumeister表示，你很少能将生物功能或细胞功能分配给单个分子——这些功能来自于居住在细胞景观中的所有分子的相互作用，这就是冷冻ET的发现潜力所在。无论我们现在看什么，都会有惊喜。

细胞社会

早期的冷冻ET工作大部分是在原核生物上进行的：单细胞生物，如细菌。这些细胞通常比真核生物的更复杂的细胞更小更薄。

例如，在2006年对Jensen的研究中，他和他的团队报告了驱动鞭毛（细菌表面的鞭状附属物）的驱动器的第一个完整结构。使用冷冻ET，他们揭示了原始密螺旋体（一种在白蚁肠道中发现的细菌）中的20片驱动器的结构，并详细说明了这些部件如何定位在细菌膜中。 Jensen等人还揭示了细菌菌毛（微生物用于许多功能的突起）的关键细节，例如附着在它们感染的细胞上并将物质分泌到细胞中。去年，他的团队发布了一个开放获取的数字地图集（go.nature.com/3nugs7v），其中重点介绍了冷冻 ET 揭示的关于细菌和其他原核细胞的许多见解。

最近，科学家们已经开始对真核细胞进行成像——与原核生物相比，真核细胞更复杂。这在很大程度上是因为冷冻FIB技术的出现，它允许研究人员在将细胞置于电子显微镜下之前将它们切成薄片。Baumeister等人使用这种混合方法来可视化分子在人类细胞核旁边的排布（图“In scoop 细胞内图谱”）。他们的工作揭示了以前看不见的纳米级细丝如何为细胞核提供结构支撑——使其成为动物细胞中最坚硬的细胞器之一。
 
即使使用FIB技术制备样品，cryo-ET也只能捕获真核细胞的一小部分，这意味着科学家需要找到一种方法来在广阔而拥挤的细胞环境中精确定位感兴趣的分子。一种解决方案是首先在光学显微镜下对蛋白质进行荧光标记，然后使用冷冻ET放大特定部分的更精细细节，从而挑选出蛋白质。

Villa等人已经使用这种技术组合来解析LRRK2的结构。LRRK2是一种与帕金森病遗传形式相关的蛋白质。他们的工作表明，这种蛋白质的突变版本粘附在名为微管的细胞骨架成分上，在它们周围形成双螺旋。该团队的研究结果还暗示，突变的LRRK2可能形成一种促进这种结合的构型，这种构型会通过阻断微管运输重要分子而引发病变。

Baumeister等研究小组已经使用这种方法来检查与亨廷顿舞蹈症和运动神经元疾病（肌萎缩侧索硬化症，或ALS）等神经元疾病相关的蛋白质如何与细胞成分（如有助于合成蛋白质的大型细胞机器内质网）相互作用。研究人员发现，与这些疾病有关的神经毒性蛋白质团块在细胞内的行为非常不同。例如，在亨廷顿病中，一种称为亨廷顿蛋白的突变形式的蛋白质聚集体似乎使内质网的组织混乱，而在ALS 中，异常蛋白质的聚集体通过激活其蛋白质降解机制来损害细胞的生物化学。

未来，科学家们希望利用这些方法，通过可视化药物如何作用于细胞的分子内部，更好地了解治疗方法的工作原理。在早期的演示中，德国海德堡欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory）的Julia Mahamid等人能够观察到与核糖体（充当蛋白质工厂的细胞器）结合的细菌细胞中的抗生素。将cryo-ET的分辨率提高到3.5埃使这一“壮举”成为可能。

未参与这项工作的Kukulski认为这可能是 [使用冷冻ET] 的最先进技术。然而，她指出核糖体在细胞中无处不在，并且已经被很好地表征，使其易于识别和研究。她补充，试图对鲜为人知或罕见的细胞结构进行成像仍然是一项非常艰巨的任务。

强大的组合

虽然Cryo-ET是一个快速发展的领域，但该技术仍有许多局限性。分辨率仍然是一个问题。尽管近年来细节水平有了很大的提高，但冷冻ET无法达到冷冻EM的原子级分辨率。 加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles）的生物物理学家 Hong Zhou指出， Cryo-ET是90年代初的低温EM，距离实现原子水平的分辨率还非常遥远。

Zhou继续指出，在目前的性能水平下，很难使用冷冻ET来正确识别细胞中的分子。因此，除非科学家们研究先前已被充分表征的结构，例如核糖体，否则他们关于使用该技术所看到的假设可能被证明是不正确的，已知的信息越少，越容易犯错。

为了规避分辨率问题，zhou选择尝试突破传统冷冻电镜的极限。他的团队最近报告了一种称为cryoID的方法，该方法将cryo-EM与各种其他技术相结合。其中之一涉及以一种使蛋白质部分保留在原始细胞环境中的方法打破细胞；通过这种方式，研究人员可以查看接近天然状态的蛋白质。尽管他目前专注于冷冻 EM，但zhou说冷冻 ET 是未来，“我认为 [这种方法] 是实现这一目标的中间步骤。”

低温ET的另一个限制是它的采样范围很窄。Villa指出，断层扫描最大的问题是，在观察哺乳动物细胞时，断层扫描仪只能覆盖不到0.1%的细胞。这意味着像细胞核这样的大细胞器只能看到一小部分。为了填补这一空白，弗吉尼亚州阿什本霍华德休斯医学研究所 （Howard Hughes Medical Institute）Janelia研究园区的生物物理学家Harald Hess等科学家正在使用冷冻ET以外的技术——超分辨率荧光显微镜和电子显微镜，来可视化整个细胞。使用这些方法，Hess等人对各种细胞成分如何相互作用有了新的认识。在本月早些时候发表的一项研究中，研究人员证明，通过使用机器学习（一种人工智能形式）来帮助识别许多样本中的这些成分，他们可以绘制多达35种细胞器类型的组织图。

其他研究人员正在将冷冻ET与另一种称为X射线断层扫描的技术相结合，该技术可以捕获整个细胞的图像。这使科学家能够检查较大组件的结构，例如线粒体或细胞核，然后放大感兴趣的特定区域。

然而，将这些方法结合在一起需要金钱和技巧。最重要的是，这两种技术都用破坏性辐射轰击样本。西班牙巴塞罗那ALBA同步加速器设施（可产生适用于断层扫描的X射线）的光束线科学家Eva Pereiro表示，这使得在它们之间转移样品成为一项挑战。

一些实验室已经完成了这一壮举。位于英国迪德科特的同步加速器设施Diamond Light Source的首席光束线科学家Maria Harkiolaki等人发表了SARS-CoV-2感染机制模型，该模型使用冷冻ET和X射线断层扫描阐明过程。他们在细胞和单个分子的水平上捕获了事件，并提出了病毒如何在灵长类动物细胞中复制的想法。

Baumeister认为，与cryo-EM一样，cryo-ET最终将使科学家能够从原子细节中观察生物分子。在此之前，科学家们继续热切地研究冷冻ET和其他类似方法可能会揭示对细胞的新见解。由于这些工具可以揭示以前从未见过的结构，因此研究人员经常面临新的谜团需要解决。Villa喜欢断层扫描，他们总是提出比答案更多的问题。

原文检索：
Diana Kwon. (2021) The secret lives of cells — as never seen before. Nature, 598: 558-560. 
张洁/编译