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shRNA表达克隆

五大流行技术进展一览

Jun 29, 2021 No Comments

五大流行技术进展一览1

 

看看已经迅速兴起的著名研究工具和项目,可以发现一些常见的成功途径。

当被要求描述他的专长时,Kaihang Wang会很直接地回答“勤杂工”。毕竟,他在帕萨迪纳加州理工学院(California Institute of Technology)的大部分工作都涉及建造东西,尽管不是用锤子和钉子。Wang和他的团队开发了分子工具,包括一个生物学家可以通过编程将一条长的、合成的 DNA 链引入细菌细胞中的系统。经过进一步思考,Wang 提供了更科学的替代方案:合成生物学或基因组工程。他表示,他们所有的努力从根本上都是由创造生物的目标驱动的。

像王一样,当手头的工具不足时,许多生物学家会跨学科寻找材料、合作者或不同的方法。这可能导致需要新定义的方法或联盟,例如“扩展显微镜”或“人类基因组编写计划”(Genome Project-write)。其中一些由于强大的技术能力和好名字在科学家中引起轰动。

在柯林斯堡的科罗拉多州立大学(Colorado State University)研究科学修辞学的 Erika Szymanski 指出,为一个领域或工具创造一个吸引人的名字可以创建一个概念基础设施,研究人员可以用它来构建调查框架。就像显微镜的限制决定了你能用它看到什么一样,我们只会关注那些名字听起来有趣的东西。有时,尝试以一种新的框架来思考我们所做的工作是富有成效的,因为它为想象新的可能性开辟了空间。

本文中,Nature 探索了过去 15 年中 5 项值得注意的技术。有些已经单独开辟了一个新的研究领域,或得到了大量资金资助;其他则加强了全球合作,或者在远离最初目标的研究中找到了新的目标。但这5项技术都是重要的科学突破,它们要么揭示了细胞功能,催生了公司和疗法,要么在大流行期间为公共卫生政策提供了信息。

 

表观转录组学

与基因组 DNA 一样,信使 RNA 可以携带改变其功能或命运的化学标签,例如甲基或糖基团。这种修饰并不统一,并且发现某些 mRNA 高度甲基化,而其它 mRNA 则似乎不受这些化学标签的影响。2012 年,纽约市威尔康奈尔医学院(Weill Cornell Medical College)的 RNA 生物学家 Samie Jaffrey 等人开发了一种方法来识别特定的、普遍存在于转录组(细胞或生物体中的完整 RNA)中的 mRNA 甲基化标记,命名为 m6A。

该研究的合著者Christopher Mason 创造了表观转录组学这一术语来解释该团队的假设,即甲基标签调节 mRNA 转录本的活性,从而表明为什么蛋白质水平并不总是与编码它们的转录本的丰度相匹配。Jaffrey认为,这可能是另一层面的遗传密码的想法非常吸引人。新名称使其他人更容易掌握这个概念。

多年来,表观转录组学已经发展为一个独立的领域,有专门的资金、会议和合作。西班牙巴塞罗那基因组调控中心 (Centre for Genomic Regulation,CRG) 的 RNA 生物学家 Eva Maria Novoa Pardo 指出,在某些方面,创造一个新词就等于创造了一个新的科研社区。

Jaffrey 和 Mason 的原始方法使用 m6A 抗体来分离长度为 100-200 个核苷酸的修饰 RNA 片段,然后他们通过测序对其进行鉴定。后来,该团队将抗体与底物交联,然后沉淀抗体结合的 RNA 片段以精确定位甲基化位点,从而生成第一个甲基化 mRNA 的单核苷酸水平图谱。这有助于识别另一类携带修饰的分子(名为小核仁 RNA)。Jaffrey 提到,他们现在开始认同一个想法:m6A 的一个主要功能是标记 RNA 以实现快速周转,这对于细胞做出调整和响应环境的能力至关重要。

随后的技术发展利用了可以在特定序列上切割非甲基化 RNA 的酶。该工具允许其开发者、以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所(Weizmann Institute of Science)的 RNA 生物学家 Schraga Schwartz 不仅检测特定位点是否被修改,还可以检测携带甲基化基序的转录本的百分比。当 Schwartz等人将其应用于整个转录组时,他们发现基于抗体的技术遗漏了近 75% 的修饰位点,这表明其敏感性有限。Schwartz 表示,看到这个结果真是一个很大的惊喜,拥有两种方法而不是一种方法可以让我们更全面地了解问题。

如今,表观转录组学研究人员可以使用纳米孔测序仪直接读取修饰的 RNA。与传统测序仪需要先通过逆转录将 RNA 转化为 DNA 不同,这些仪器使 RNA 分子通过蛋白质纳米孔,产生独特的电流,然后解码以提供 RNA 序列。使用解码电流的测序算法解读甲基化的 m6A 核苷酸,经常会产生一些错误信息。因此,在 2019 年,Novoa 等人设计了一种算法(今年早些时候他们对这个方法进行了更新),使用这些错误信息来预测哪些位点携带甲基化核苷酸。Novoa 指出,对天然 RNA 进行测序的可能性——无需先将其逆转录成 DNA——开启了对转录组的完全公正的看法。

 

人类细胞图谱

2003 年人类基因组测序的完成,以及研究单细胞的新工具的出现,科学家们开始畅想:他们是否可以绘制每个人类细胞的独特位置、行为和发育图。英国欣克斯顿威康桑格研究所(ellcome Sanger Institute)的遗传学家Sarah Teichmann和现在在加利福尼亚州南旧金山基因泰克 (Genentech) 的计算生物学家 Aviv Regev 也在探索这种想法。

2016 年底,Teichmann、Regev 和其他人聚集在一起讨论这个想法。人类细胞图谱计划(Human Cell Atlas)因此诞生。这是一个使用单细胞方法绘制每个人类细胞、组织和器官的组织、遗传学和生物学的项目。该小组强调开放、协作的方法:任何人都可以参与,并且该联盟使用广泛的分子和计算方法收集信息。

在 CRG 研究单细胞测序技术并领导该联盟标准和技术工作组的 Holger Heyn表示,没有一种金标准技术能够实现所有目的。每种方法都有偏见。我们整合的技术越多,偏见就越少。

在 2020 年的一项研究中,Heyn 等人在一组常见的参考样本中比较了 13 种单细胞 RNA 测序技术,并根据它们发现细胞特异性标记物的能力来评价它们。他们发现,结果变化的一个主要来源是样本中细胞的大小。Heyn等人的目标不是找到赢家或输家,而是定义每种技术能够获取哪些信息。

人类细胞图谱联盟现在在 77 个国家/地区拥有近 2,200 名成员,他们总共分析了来自 14 个主要器官的约 3,900 万个细胞,并发表了近 80 篇出版物,而且这个数字还在不断增加。

这些数据有助于解开 COVID-19 的奥秘。2020 年初,联盟成员汇集了 26 个已发表和未发表的数据集,以了解冠状病毒 SARS-CoV-2 如何侵入肺组织。他们绘制了病毒用于进入组织(包括鼻子、嘴巴和眼睛等组织)的细胞表面受体图。此后,世界各地的研究人员使用该图谱来了解感染过程。Teichmann表示,它甚至有助于为公共卫生政策提供信息,例如要求人们戴口罩的政策。这场大流行对人类细胞图谱项目来说确实是变革性的,它向你展示了细胞图谱的价值——即使是早期的、不完整的。

 

扩展显微镜

尽管许多痴迷于显微镜分辨率的研究人员专注于构建更好的硬件,但神经科学家 Ed Boyden 采取了不同的策略。他与剑桥麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)的同事一起设计了一种名为扩展显微镜(Expansion Microscopy)的技术,它可以像给气球充气一样放大细胞和组织。

该方法将一种称为丙烯酸酯的单体注入样品中。加水会导致单体聚合和膨胀,随着其膨胀,细胞成分被推开。在早期的尝试中,细胞破裂或膨胀不均匀。但是在聚合之前添加酶来软化组织使研究人员能够将小鼠脑组织扩大到原始大小的4.5 倍。两年后,该团队将该方法扩展到十几种组织类型,其中一些可以扩展 16 倍。Boyden指出,确保物理放大倍数正确缩放对于该技术至关重要。

今年,Boyden等人利用这个概念来定位组织中的特定 RNA,这是一个名为空间转录组学的子领域。他们首先扩展了小鼠脑组织的一部分,然后对嵌入的 RNA 进行了原位测序。

德国法兰克福马克斯普朗克脑研究所(Max Planck Institute for Brain Research)的神经科学家 Erin Schuman 研究蛋白质如何在名为突触的神经细胞连接处形成。长期以来他们一直依靠银染等间接方法来可视化这一过程。Schuman想直接在突触中看到新制造的蛋白质。但是突触是由长而细的纤维形成的,这些纤维被称为轴突,缺乏良好的分子标记。Schuman 提醒,它们实际上是最难以研究的事物之一。

使用扩展显微镜,Schuman等人第一次看到几乎所有的轴突末端都有合成新蛋白质的机制。 Schuman认为它确实帮助她们以高度可靠的方式分析突触,并进行高通量分析。

在加利福尼亚州斯坦福大学(Stanford University),生物工程师 Bo Wang 使用该工具创建了一张高分辨率图像,展示了常见肠道病原体沙门氏菌如何与人体细胞相互作用。在优化版的“软化”步骤时,Wang等人发现该方法可用于测量细菌细胞壁的硬度,这对于理解该细菌对抗生素的抗性和宿主防御至关重要。测量微型物体的机械特性很困难,但扩展显微镜帮助团队测量了单个批次中数千个细胞壁的强度,以了解细菌如何对宿主防御机制做出反应。 Wang认为,类似的策略可以帮助解答植物、真菌和许多不同物种的生理问题。

 

五大流行技术进展一览2

将扩增显微镜与 RNA 测序相结合(左)揭示了小鼠视觉皮层中神经元的组织(右)。

 

 

脑虹

2007 年,由马萨诸塞州剑桥市哈佛大学神经科学家 Jeff Lichtman 和 Joshua Sanes 领导的团队开发出一种方法来区分小鼠大脑中缠结的神经元。研究人员构建了一个系统,其中编码荧光蛋白的基因由特定于神经元的调节序列控制,该序列两侧是标签,这些标签将引导重组酶对这些荧光基因进行重组。细胞转染这些荧光基因后,研究人员激活识别重组标签的蛋白质时,它会将基因改组为各种随机组合,表现为彩虹般的荧光。因此,这种工具被名为Brainbow(脑虹)。

作为纽约大学(New York University)的一名研究生,Gabriel Victora还记得当年看到那些万花筒般的大脑图片时受到的震撼——每个细胞都有不同的色调。但 Victora 的研究集中在生发中心、免疫细胞分裂和生长的淋巴结中的微观结构。现在纽约市洛克菲勒大学(Rockefeller University)的免疫学家 Victora 表示,他们没有立即想到使用这项技术,他记得当时在想,‘可惜那是在脑子内部’。

Lichtman 希望标记单个细胞的能力将有助于解决精细尺度的细节问题,例如大脑中的突触连接。但是小的细胞结构具有较少的荧光分子,产生的荧光信号亮度不够——通常太暗而无用。Lichtman 表示,他对这个结果很失望,因此从那以后转向了诸如连续切片扫描电子显微镜之类的技术。在这种技术中,一块组织被重复成像,剥开并再次成像以绘制神经连接图。你必须为这项工作找到合适的工具,在这种情况下,Brainbow 不够用。

Lichtman 确实使用 Brainbow 进行了周围神经系统的实验,其中细胞相距较远,因此甚至可以观察到微弱的荧光。其他团队已经为不同的生物调整了该工具——例如,用于果蝇大脑的 Flybow 和用于斑马鱼组织的 Zebrabow。将 Brainbow 与扩增显微镜相结合,研究人员可以检查哺乳动物组织中的细胞形状和连通性。

在一种名为Confetti 的小鼠模型上,将脑虹技术扩展到非神经元细胞的研究重新点燃了Vicora对 Brainbow 的兴趣。在淋巴结的生发中心内,B 细胞簇产生不同的抗体,并争相茁壮成长。大多数生发中心保持着抗体分子的多样性。但Victora 等人发现,在5-10%的这些结构中,能产生高亲和力抗体的细胞可以迅速胜过其它 B 细胞,并接管生发中心。使用 Brainbow 跟踪这些“克隆爆发”的研究人员在第一次标记细胞时看到生发中心的所有细胞都呈现不同的颜色。然后,当一个显性克隆接管时,它的后代——所有这些都与母细胞具有相同的颜色——将生发中心从彩色变为单色。Vicora表示,Brainbow 非常清楚地显示了这种 [B 细胞之间] 的分工。

 

 

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Brainbow 标记的生发中心。

 

 

人类基因组编写计划

如果科学家能够制造出完整的合成染色体,他们就可以赋予细胞新的功能,更换致病的遗传途径或设计新的实验系统进行研究。但是合成染色体不能一次性构建。

2010 年,研究人员拼凑出第一个合成细菌基因组。他们将生物体的 DNA 改造成短链,将它们缝合在一起,然后一次交换一部分染色体,直到天然 DNA 完全被合成对应物取代。加州理工学院的Wang表示,自从第一次尝试以来,这个过程基本保持不变。尽管在细菌和酵母方面取得了显著进展,但该技术从未扩展到具有更复杂基因组的生物体。然后,在 2016 年,研究人员宣布了人类基因组编写计划(Genome Project-write),旨在合成复杂的基因组,包括人类的基因组。

由于资金和技术挑战(Nature 557, 16-17; 2018),该项目启动时雄心勃勃,后面却不得不缩小其目标,以专注于设计一种对病毒具有抗性的人类细胞系。但这种规模的 DNA 合成仍然是一个挑战,编码新功能的遗传回路的设计也是如此。麻省理工学院的合成生物学家Christopher Voigt表示,目前,此类工作在很大程度上仍局限于个人研究人员或小团队。如果大规模基因组合成变得可行,那么这个过程必须改变。他指出,这就像一个人建造一架飞机,从设计到将零件粘合在一起。这表明,我们距离从基因组水平上去设计点东西有多遥远。

Wang认为,尽管如此,这个崇高的目标仍然可以推动领域向前发展。生成全基因组的动机推动了技术的发展。这是一个循环:一旦我们有了工具,它就会使基因组合成更加现实,人们将更多资源投入该领域。

 


原文检索:
Jyoti Madhusoodanan. (2021) Five trendy technologies: where are they now? Nature, 594: 602-604. 
张洁/编译

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