野生动物的干细胞模型

当传统的实验室模型失败时，来自松鼠、海豹和其它物种的干细胞可以给研究人员提供帮助。

2007年，Wei Li已经确定了他认为研究色彩视觉的完美模型：十三条纹地松鼠（Ictidomys tridecemlineatus）。这些松鼠是常见的草原居民，它们用自己的后腿站立，像猫鼬一样打量周围的环境。在它们的视网膜中，有大约86 %的感光细胞是锥体细胞，它们能对各种波长的颜色作出反应。在人类和小鼠中，锥体细胞只占不到10 %的比例。但松鼠生物学特性，让Li不得不搁置他的想法。

因为陆地松鼠会冬眠，所以每年有6个月，Li的研究对象都会在冷库里睡觉。而位于马里兰州贝塞斯达的美国国家眼科研究所（National Eye Institute）的视觉研究员Li和他当时的博士后研究员Jingxing Ou清楚，来自如大鼠、小鼠、果蝇甚至人类的传统模型的细胞，都不会给他们提供所需要信息，因此，他们选择从松鼠身上获取干细胞。他们从成年松鼠身上获得细胞，将它们重新编程至胚胎期的、未分化状态，即所谓的诱导多潜能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞，然后促使这些细胞形成他们所需的视网膜组织。

Li只是众多无法使用传统模型回答生物学问题的研究人员之一。研究肺部疾病（包括COVID-19）的研究人员经常使用雪貂作为研究对象，因为它们的支气管比小鼠或大鼠的气管更接近于人类器官。其他研究者则转向干细胞来研究物种的特异性状，或制造濒危物种的配子以达到保护目的。Li表示，如果是容易接近或获取原代细胞比较容易的动物，则可能不需要iPS细胞。但如果不是这样，那么iPS细胞是研究物种内在特征的下一个最佳选择。

做出有效的细胞系并不容易，从重编程成体细胞到诱导产生干细胞的准确分化，每一个实验步骤都需要独创性和分析解决问题的能力。为普通实验室模型设计的方案必须针对其它物种进行调整和优化，研究人员经常发现自己在盲目前行，既没有可参考的基因组，也没有细胞独特的生物学知识来指导他们。加州拉霍亚的斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的干细胞生物学家Jeanne Loring表示，这有点像细胞培养的直觉，需要能够提出自己的一套技术方案。

未开辟的领域

iPS细胞一般是通过使用四种DNA结合蛋白（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）而创建的，这四种蛋白以其发现者Shinya Yamanaka的名字统称为Yamanaka因子（Yamanaka factor）。研究人员将编码这些转录因子的基因传递给培养的细胞，然后观察多能性的迹象，包括细胞形状和基因表达的变化。

Loring和她的团队已经从他们在人类细胞的iPS细胞创建中熟悉了这一过程。他们在加州圣地亚哥动物园保护研究所（San Diego Zoo’s Institute for Conservation Research）的实验室之行中的一次偶然谈话促使他们探索在濒危物种中尝试这一过程的可能性。该研究所主办的“冷冻动物园”（Frozen Zoo），保存了大量动物的冷冻细胞，包括常见的和濒危的物种。Loring表示，以前从来没有人尝试对一个物种用另一个物种的因子进行重新编程。

Loring提醒，每个物种都有独特的需求，研究人员可能需要尝试几十种载体、转录因子来源和培养条件的组合。对于极度濒临灭绝的北方白犀牛（Ceratotherium simum cottoni），她的团队发现，细胞需要比人类实验方案所需的更高剂量的Yamanaka因子，而且其中有一个因子是多余的。

由于重编程过程往往效率不高，雅典乔治亚大学（University of Georgia）的干细胞研究员Steven Stice建议研究人员从容易增殖的细胞培养开始操作。被称为“成纤维细胞”（fibroblast）的皮肤细胞是一个常见的起点，因为收集它们比较容易，但它们在一些物种中也很难被重编程。Stice曾用成年猪、牛和家畜物种的成纤维细胞构建iPS细胞，但在构建鹌鹑时，转而使用了胚胎成纤维细胞。据Stice解释，因为胎儿细胞不太可能衰老，所以增加了成功的几率。

就他而言，当Ou从成年松鼠细胞转换成来自新生幼崽的神经前体干细胞，以及从小鼠重编程因子应用到人类对应的细胞时，他成功了，也许是因为地松鼠的基因与小鼠的基因相比与人类的更相似。现任是中国广州中山大学（Sun Yat-sen University）干细胞研究员的Ou表示，啮齿动物的实验方案总是失败。

新西伯利亚俄罗斯科学院（Russian Academy of Sciences）的干细胞研究员Aleksei Menzorov表示，另一个选择是克隆物种自身的基因来制造Yamanaka因子。但对许多物种来说难度很大，包括Menzorov研究的环斑海豹（Phoca hispida），因为基因组序列并不总是可获得的。他表示，在资源有限的情况下，使用标准的Yamanaka因子更容易。

为了将这些因子传递到培养的细胞中，研究人员建议从慢病毒或逆转录病毒载体开始尝试，因为它们能整合到宿主细胞基因组中，所以很容易被检测到。但有时，基因组必须保持不变，比如在治疗学和生殖研究中的应用。这是因为即使是微小的差异也可能引发致癌突变。而在配子中，病毒可能会意外地改变一个物种的固有基因组，Loring表示，重要的是不要留下“足迹”。

Loring的团队使用不整合到基因组中的仙台病毒载体，为濒临灭绝的北方白犀牛制造干细胞。而洛杉矶南加州大学（University of Southern California）的干细胞研究者Amy Ryan则使用了一种被称为质粒（plasmid）的非整合到宿主基因组的环形DNA分子来进行雪貂的研究。

生长介质和培养皿上的表面涂层的差异也会影响重编程。胎牛血清是生长因子的丰富来源，通常被添加到小鼠干细胞培养中。但Stice发现，血清白蛋白和确定的生长因子的混合往往会产生更好的结果。他表示，血清可能是最好的选择，但iPS细胞有时很挑剔，喜欢特定的添加成分。

衡量成功

与原本是扁平的，并在培养皿中伸展的成纤维细胞不同，人类和小鼠的iPS细胞通常是圆形的，并形成紧密的细胞集落。在其它物种中，iPS细胞看起来是有区别的，例如，形成了许多产生扁平、松散的颗粒状细胞集落。Loring表示，即便如此，iPS细胞集落和其亲代培养之间的物理差异往往是“第一个附赠品”，因为诱导已经起作用了。

除此之外，研究人员通常通过确认细胞能够分化成三个原始生殖层组织（内胚层、中胚层和外胚层）来评估其多能性。而且他们经常使用核型分析（一种能使细胞的染色体分散并计数的过程）来确认重编程过程没有引入重大的基因异常，这是一种罕见但可能存在的结果。

Ryan和她的团队发现雪貂干细胞难以维持和分化，这可能是因为这些细胞从其起源的组织中保留了化学标记，称为“表观遗传标记”（epigenetic marker）。Ryan认为肯定有一些表观遗传修饰阻碍了多能性。

事实上，表观遗传学使干细胞生物学家在多个层面上感到困惑。东京庆应大学（Keio University）的干细胞科学家Hideyuki Okano和日本熊本大学（Kumamoto University）的Kyoko Miura是成功从裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）中生成iPS细胞的科学家之一。他们发现，他们必须通过抑制肿瘤抑制基因的表达来覆盖表观遗传信号，以改善干细胞的形成能力。

跨物种观点

Ou表示，表观遗传标签也可能影响干细胞的分化方式。从非模型生物的iPS细胞中制造有用的工具，最具挑战性的是开发一个良好的分化方案。他已经掌握了将松鼠干细胞分化成视网膜样类器官的技术，但却难以为一个不同的项目制造心肌细胞。而当Menzorov使用一种专门用于生长神经元的培养基时，他最终得到的却是贮脂细胞和骨细胞，而这些细胞通常需要特定的生长因子才能形成。Ou表示，在没有任何添加物的情况下，在另一种介质中产生脂肪细胞是意想不到的，非常有趣。

与来自模型生物的生长因子相比，一些细胞在自身物种生长因子的作用下分化得更好。在肺部细胞的研究中，Ryan正致力于生产雪貂版的FGF2因子，她发现该因子对维持多能干细胞系和使它们分化至关重要。她表示，对于其它生长因子来说，起源物种却并不那么重要。

这样的差异可以深入了解其它物种的生物学，往往对我们自己也有提示作用。例如，Miura指出，了解如何从抗癌生物体中制造干细胞，可以揭示出相反的方法：即减少基于人类干细胞的疗法的风险可能无意中导致癌症。重编程过程和肿瘤发生有几个共同的特点。

从Li的松鼠干细胞中分化的神经元也产生了惊喜。不同于在低温下破裂的人类细胞中的细胞骨架，由松鼠iPS细胞衍生的神经元中的细胞骨架能保持其完整性，这可能是动物进化成可以承受冬眠的一种特征。Li认为，干细胞使我们能够探索这些关键的细胞过程，有些功能可以在细胞培养中发现，否则就无法发现。

原文检索：
Jyoti Madhusoodanan. (2020) A menagerie of stem-cell models. Nature, 585: 623-624.
郭庭玥/编译