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shRNA表达克隆

寻找诊断冠状病毒的测试方法有助遏制新冠疫情

Jul 28, 2020 No Comments

病毒诊断通常依赖于鼻拭子样本,研究人员正在开发更快、更简单和更便宜的检测方法。

病毒诊断通常依赖于鼻拭子样本,研究人员正在开发更快、更简单和更便宜的检测方法。


研究人员正在努力寻找能每周进行数百万次的、诊断冠状病毒的测试方法——这是遏制新冠疫情的关键一步。

情况再糟糕不过了。今年3月,就在泰国的冠状病毒爆发开始加剧之际,曼谷的三家医院宣布,它们已暂停对病毒的检测,因为它们的试剂已用完。泰国研究人员立即采取行动,帮助该国的临床实验室满足需求。为了寻找价格低廉且易于使用的检测方法,Vidyasirimedhi科学技术研究所(Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology)的系统生物学家Chayasith (Tao) Uttamapinant联系了一位老熟人:CRISPR的共同发现者张锋。张锋受基因编辑技术的启发,一直在开发冠状病毒的检测方法。

仅仅几天,Uttamapinant便收到了张锋在麻省理工-哈佛大学布罗德研究所(Broad Institute of MIT and Harvard)的实验室提供的试剂盒,并在曼谷一家医院的样本上进行了测试。Uttamapinant指出,这种试剂非常便宜,而且效果很好。他希望在今年年底之前让这种测试被批准用于临床。他已经与泰国的生物化学家合作,在当地生产测试试剂,张锋随时准备提供支持。Uttamapinant还表示,这种在本国生产各种产品的努力将对泰国的传染病监测和诊断产生持久影响。

流行病学家指出,SARS-CoV-2的大规模检测——每个国家每周需要进行数百万次检测——是摆脱当前危机的最实际的方法。它允许官员隔离那些检测呈阳性的人,限制疾病的传播,并帮助确定何时放松限制是安全的。

各国在加强检测上遇到诸多困难。原因之一是检测SARS-CoV-2的标准测试——逆转录聚合酶链式反应,或RT-PCR(reverse-transcription polymerase chain reaction)需要训练有素的人员、特定的化学用品和昂贵的仪器,同时出结果需要数小时,而且往往一般由集中提供该项服务的实验室进行检测。这限制了检测的数量,特别是在发展中国家。即使在美国这样的富裕地区,由于供应链问题,供应商也报告说检测试剂盒和所需材料——从鼻拭子到化学试剂——严重短缺。事实证明,迅速扩大可靠的检测也具有挑战性:例如,美国疾病控制和预防中心(US Centers for Disease Control and Prevention)开发的早期RT-PCR检测出现故障,导致了一系列延迟。

世界各地的研究小组现在正在设计PCR以外的检测方法。数十种诊断方法正在开发中,所有这些方法都能以不同的方式检测病毒物质:有些是对RT-PCR进行了微调,使检测更快或更容易使用;其他人使用基因编辑工具CRISPR锁定SARS-CoV-2的基因片段;有些人利用病毒表面的蛋白质来识别病毒。许多这样的测试,比如张锋开发的测试,正在使用临床样本进行验证,有些已经进入临床。今年4月,美国国立卫生研究院(US National Institutes of Health)拨款15亿美元用于开发冠状病毒测试,希望在今年夏末之前每周进行数百万次测试。张锋指出,我们越早想出解决办法,就能越早遏制疫情。

纽约罗切斯特大学(University of Rochester)的生物化学家Mitchell O’connell表示,进行大量测试最有希望的方法是使用多种方法,这些方法依赖于不同的仪器和供应链,这样世界范围内的突然需求不会耗尽任何关键材料。任何能够扩大我们所能做的测试数量的新技术都是好消息。”

如果这些测试能尽快就绪,这对当前的大流行和未来的爆发都是好消息。瑞士日内瓦大学(University of Geneva)的病毒学家Isabella Eckerle提到,一旦新出现的病原体的基因序列被破译,许多正在开发的检测方法就可以很容易地适应它。尽管理想的测试方法——一种准确、快速、廉价、易于使用和扩大规模的方法——还不存在,但是还有许多可能有用的方法正在研制中。

 

PCR之外

对冠状病毒的测试分为两大类:一类检测来自病毒的遗传物质或其表面分子,用于诊断某个个体是否有一个活跃的感染;另一类检测受试者体内是否存在病毒对应的抗体,揭示该个体是否被感染,并针对病毒产生了一个免疫反应。抗体测试的诊断用途有限:如果一个人在感染的早期进行测试,那时他们的免疫反应仍在形成,测试可能无法检测出抗体。由于冠状病毒感染者在出现症状时传染性最强,对病毒物质的检测对于确定应隔离哪些人至关重要。在美国,第一类,即病毒诊断是主流测试。

黄金标准的诊断测试使用RT-PCR,通过从人的鼻子或喉咙的细胞或液体中寻找SARS-CoV-2的特定基因序列。如果发现了病毒序列,该技术将其放大到可以检测到的水平。首先,病毒RNA被转化为DNA。然后,被称为引物的短设计DNA序列可以执行多种工作。一些标记病毒遗传密码的特定部分,以帮助复制数百万次的序列,整个过程需要反复加热和冷却。这种放大使得即使是极少量的病毒,也能很容易地检出,即使每微升只有一个RNA分子也能检出。其它的引物则是在扩增的DNA链上添加标签。这些标签会释放荧光信号,由计算机测量,显示病毒的存在(图“检测技术”)。针对冠状病毒的标准RT-PCR检测需要1 – 4个小时,准确率可达100%——尽管任何诊断检测的准确性取决于许多因素,例如在感染过程中何时采集样本。

各种方法的目的是减少获得测试结果所需的时间,例如在恒温下扩增DNA,这样就不需要多次加热和冷却。其中一些是现有的(检测其它病毒的)检测方法,正在定制以检测SARS-CoV-2。例如,美国医疗保健公司Cepheid和Abbott开发了冠状病毒检测,在烤箱大小的硬件平台上运行,执行时间不到一小时。然而,试剂和平台可能很昂贵,且Abbott公司提醒,使用一种特殊的溶液来稀释病人的样本可能会导致设备无法检出病毒。

其他一些测试基于一种名为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的技术。这种技术也在恒温下工作,已被用于识别寨卡病毒(Zika virus)。LAMP依赖两种酶——一种将病毒RNA转化为DNA,另一种用于复制DNA——以及一组4到6个短引物,用于识别病毒基因组的不同片段。这些片段不仅有助于启动复制,就像在RT-PCR中一样,而且还允许新复制的DNA链形成环状结构,这种环状结构可以比标准PCR扩增得更快(图“LAMP测试”)。然而,它的准确性较低,一次只能运行几十个样本。

斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院(Karolinska Institute)的基因组学专家Vicent Pelechano指出,由于这项技术不需要特殊的仪器,它可以用于边远地区和缺乏先进设备的地区,包括偏远地区和难民营。你所需要的只是一个装有引物的试管、一个移液管、一个热板和一壶水。不算人工费用的情况下,一次测试的成本约为1美元。

在实验室里,Pelechano等人基于LAMP的测试可以在40分钟内检测到10个SARS-CoV-2基因组。然后,研究人员使用248名确诊感染冠状病毒的患者的样本对该方法进行了测试,发现该病毒的几率接近90%。Pelechano承认,对于一些样本,比如那些被血液污染的样本,测试结果可能会不太准确。

但在某些地方,牺牲一部分的准确性可能是值得的。瑞典于默奥大学(Umeå University)的临床微生物学家Nabil Karah表示,低收入国家和战乱地区没有足够的PCR仪来进行冠状病毒的标准诊断测试。Karah正在与其他科学家以及Pelechano的团队合作,将他们的基于LAMP的测试带到叙利亚,以提高当地的测试能力。

检测技术

 

LAMP测试

 

加速试验

3月初,当诊断技术难以跟上冠状病毒在美国的传播时,化学工程师Howard Salis感到有必要帮忙。为了加快测试速度,他决定尝试一种强大的测序方法,这种方法彻底改变了基因组学研究的步伐。大约三周后,Salis所在的宾夕法尼亚州立大学(Pennsylvania State University)的合成生物学家团队想出了一种方法,可以一次性测试近2万人的样本。

他们的方法是将单个的“分子条形码”添加到临床样本中,然后将它们汇集起来,并使用下一代测序技术一次性对其进行解码。条形码可以帮助研究人员识别哪些样本检测呈阳性。其他团队也公布了类似的大规模测试方法的细节,包括位于加州Emeryville的生物技术初创公司Octant,以及Broad研究所的研究人员。

由于DNA测序仪可以一次读出数亿个DNA片段,研究人员估计,基于测序的测试一次可以分析多达10万个样本。相比之下,标准的PCR仪只能同时检测数十或数百个样本。但这种测序测试需要时间,至少需要12个小时,而且需要集中设施中的专用设备。将数以百万计的样品送到这些集中设施可不是件容易的事。

研究人员试图将测试推向大众的另一种方式是设计出可以在临时测试设施、“得来速”(即停即走)测试中心,甚至是人们家中使用的化验方法。

至少有两个团队正在利用基因编辑技术CRISPR为此类测试提供动力。例如,由张锋领导的研究人员已经开发出一种可以在一根试管中运行约1小时的冠状病毒试验。但是它仍然需要将样品加热到65℃左右,而且它不如基于PCR的检测方法灵敏。张锋指出,这没什么,因为它更容易使用。对12名冠状病毒感染者的样本进行多次检测后,该方法几乎在所有情况下都能检测到病毒。

该测试基于张锋在2017年合作开发的名为SHERLOCK的方法。该方法依赖CRISPR机制对特定基因序列进行定位的能力。研究人员设计了一种引导分子来锁定SARS-CoV-2基因组的特定部分。如果引导分子找到匹配,一种CRISPR酶就会产生一种可以被检测到的信号,这种信号可以是荧光,也可以是试纸上的暗带(图“剪切然后检测”)。5月6日,FDA批准了一项用于紧急情况的SHERLOCK冠状病毒检测。该测试由马萨诸塞州剑桥的生物技术公司Sherlock BioSciences(张锋是该公司的联合创始人)进行,该公司已与一家制造商合作批量生产试剂盒。

Mammoth生物科学公司是一家诊断公司,由CRISPR先锋、加州大学伯克利分校(University of California, Berkeley)的Jennifer Doudna联合创立。Mammoth生物科学公司的首席技术长、联合创始人Janice Chen表示,该公司也在寻求获得基于CRISPR的冠状病毒测试的紧急使用许可。该试验是基于先前的结果,该结果表明该技术可以检测人乳头瘤病毒。Mammoth公司正在努力使这项测试变得简单廉价,任何人都可以在家里使用。最终的目标是把诊断技术直接送到消费者那里——PCR技术还不能家用。

澳大利亚悉尼新南威尔士大学(University of New South Wales)的生物工程师Guozhen Liu表示,CRISPR等技术可能会成为当前疫情的“游戏规则改变者”。由于它们能够快速而精确地识别基因片段,这些方法就像是“大海捞针”。它们使用基于RT – PCR的不同试剂——在标准测试缺少化学物质时很有用——而且它们可以被设计成针对任何病原体。例如,由Broad研究所的计算生物学家Pardis Sabeti领导的一个团队创造了一部智能手机大小的橡胶“芯片”,可以为一种病毒搜索1000个样本,或为169种已知会感染人类的病毒搜索5个样本。


剪切然后检测

 

表面分子测试

另一种更快、更便宜的诊断测试方法是寻找病毒表面的分子,而不是试图检测病毒的基因组。这种测试将包含一种专门针对特定蛋白质或抗原的抗体——类似于用于家庭验孕的技术。这些化验方法生产成本低,操作简单,已经用于检测流感感染。但抗原测试不像病毒测试那样包含扩增步骤,所以它们不那么敏感。

5月8日,FDA首次批准紧急使用冠状病毒抗原测试,该测试针对病毒表面的核衣壳蛋白。台北中央研究院(Academia Sinica)的计算生物学家Yang An-Suei指出,台湾FDA正在评估一种类似的测定方法,可在20分钟内得出结果。Yang的团队利用人工智能来识别能够与冠状病毒表面蛋白质结合的抗体。Yang表示,研究人员还没有在感染者的冠状病毒样本上进行测试。

即使一项测试在实验室中取得了良好的效果,它要大规模使用仍然面临着一段艰难的旅程。第一个挑战是验证性能,因为质量可能不同。创新新诊断基金会(Foundation for Innovative New Diagnostics, FIND)的首席执行官Catharina Boehme指出,对于试验的发展来说,这还是一片荒野。该基金会是日内瓦的一个非盈利组织,正在与世界卫生组织和日内瓦的大学医院合作评估数百种SARS-CoV-2测试方案。Boehme表示,大多数基于RT – PCR的检测表现和金标准检测一样,而抗原检测到目前为止表现不及预期。

另一个障碍是大规模生产。鉴于这一限制,Boehme认为在年底之前部署所有的新测试是不现实的——尽管可能会有一小部分。但是一旦它们可用,它们就可以与金标准一起工作,推动各国接近每周进行数百万次检测的目标,并为下一次大流行做好准备。

Boehme指出,即使是在这次试验中,研究人员也不能忽视对其它引起呼吸道症状的病毒的测试,以及对糖尿病等疾病的监测,这些疾病可能会使COVID-19患者的病情恶化。我们不能局限于对冠状病毒的检测。


原文检索:
Giorgia Guglielmi. (2020) The explosion of new coronavirus tests that could help to end the pandemic. Nature, 583: 506-509.
张洁/编译

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