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shRNA表达克隆

触觉从何而来

Jan 14, 2020 No Comments

在一些动物身上,三个叶片状的蛋白质一起形成了Piezo1通道

在一些动物身上,三个叶片状的蛋白质一起形成了Piezo1通道(Piezo1 channel),这有助于细胞感知触觉。

 

 

科学家正在聚焦压力敏感蛋白,试图破译细胞能够感知紧张和压力的奥秘。

一名小女孩竭力稳住自己的胳膊和手,可是手指却在不停地扭动。如果她闭上眼睛,扭动就更厉害了。这并不是说她缺乏保持四肢不动的力量——她似乎只是无法控制自己的手。

Carsten Bonnemann还记得2013年在加拿大卡尔加里的一家医院检查这名少女的情景。作为马里兰州贝塞斯达美国国家神经疾病和中风研究所(US National Institute of Neurological Disorders and Stroke)的儿科神经病学家,他经常出差去分析令人困惑的病例。但是他从来没有见过这样的事情。

如果不看着自己的四肢,小女孩似乎就无法感知自己的四肢在哪里。她缺乏对自己身体在空间中的位置的感知,这是一种被称为本体感觉的重要能力。对此,Bonnemann认为,这简直是不可能的事情。

他的团队对这名女孩以及另一名有类似症状的女孩的基因进行了测序,结果发现一种名为PIEZO2的基因发生了突变。非常幸运的是,就在几年前,研究人员在寻找细胞感知触觉的机制时发现,这种基因编码了一种对压力敏感的蛋白质。

几十年来,人们一直在寻找控制触觉的机制,而Piezo2及其相关蛋白Piezo1的发现是这一过程中的一个里程碑式的发现。Piezo是离子通道——细胞膜上允许离子通过的通道——它对张力很敏感。加州拉荷亚市斯克里普斯研究所(Scripps Research)的分子神经生物学家Ardem Patapoutian指出,他们已经了解到了很多关于细胞如何交流的知识,而且几乎总是关于化学信号的。他的小组首次鉴定了Piezos。Patapoutian等人现在意识到的是,机械感觉这种物理力量也是一种信号机制,但他们对它知之甚少。

Patapoutian表示,触觉是几乎所有组织和细胞功能的基础。生物体通过解读力量来理解周围的世界,享受爱抚,避免痛苦的刺激。在人体内,细胞感知血液流动,空气使肺部和胃或膀胱充盈,听觉则是基于内耳细胞感知声波的力量。

在过去十年里,对Piezo和其它机械敏感离子通道的研究出现了爆炸性的增长。在过去三年里,仅关于Piezo就发表了300多篇论文。其中一个最大的问题是位于细胞膜上的Piezo是如何感知和响应力的。利用低温电子显微镜(cryo-EM)技术,科学家在揭示压电通道独特的三叶结构方面取得了进展,但一个完整的机制始终匮乏。研究人员还发现Piezo的作用并不局限于触觉或本体感觉。例如,Piezo可能有助于解释为什么某些人对疟疾有抵抗力,甚至可能有助于解释为什么宇航员在太空中会失去骨密度。研究人员已经开始考虑用药物靶向这些压力感受蛋白来治疗慢性疼痛等疾病。

 

难以捉摸的触觉

长久以来,触觉一直是一种难以捉摸的感觉。Patapoutian表示,其它感官,如视觉或味觉,更容易理解:光子打在眼睛上或化学物质渗入鼻子和舌头上的细胞,都会激活同一家族的感受器。这些受体触发离子通道打开,允许阳离子进入。这使细胞去极化,将刺激转化为大脑可以解码的电信号。

科学家怀疑,在触觉、本体感觉和听觉中,有一种蛋白质同时充当力传感器和离子通道,因为在听觉中,信号传递的速度非常快——只有几微秒。但是这些统一的感觉通道蛋白的身份仍然很神秘——至少在哺乳动物中是这样的。研究人员在细菌、果蝇和线虫中发现了一些机械敏感通道。

鉴于此,Patapoutian和他的同事Bertrand Coste想出了一个计划。他们将从一种小鼠细胞开始,他们知道这种细胞能够将移液管的一下轻戳转变成可测量的电流。然后,Coste会剔除每一批细胞中不同的离子通道候选基因,寻找突然失去触觉敏感性的细胞。Coste一开始很自信,认为可能只需要几个月,甚至几周就能找到一个机械敏感基因。

但最后花了差不多一年。然后,在2009年底前不久,他发现了一些东西——或者说,没有发现响应。在敲除了一个基因后,Coste用他的移液管戳了戳细胞,细胞毫无反应。他想自己一定是切断了一个感应力的通道。

据现就职于法国国家研究机构(French national research agency, CNRS)的Coste回忆,那是非常美好的一天。他和Patapoutian将这种老鼠的基因命名为“Piezo1”,这个词来自希腊文“压力”,随后他们很快就发现了“Piezo2”。后来,研究小组将“Piezo2”直接与小鼠的感觉神经元和皮肤细胞的触觉联系起来。

 

隐藏的叶片

据Goodman回忆,研究人员对这个结果议论纷纷,尤其是因为Piezo的结构是如此之大和复杂。Piezo1由超过2,500个氨基酸组成,重达300千道尔顿,跨越细胞膜38次。(相比之下,哺乳动物蛋白通常只含有近500个氨基酸。)

不幸的是,这种巨大的尺寸阻碍了研究人员试图回答压电领域最热门的问题:这些通道如何感知力?它们是如何打开和关闭的呢?纽约市洛克菲勒大学(Rockefeller University)的生物物理学家Roderick MacKinnon指出,蛋白质结构对解决这类问题很有帮助,只有当我们了解蛋白结构之后,才能分析它的功能。

北京清华大学的神经科学家Bailong Xiao表示,X射线晶体学和核磁共振波谱等结构技术很难处理大而复杂的蛋白质。Xiao曾是Patapoutian实验室的博士后研究员。

幸运的是,2013年,当Xiao建立他的实验室时,另一种获得高分辨率结构的方法出现了:低温电子显微镜(cryo-EM)。2015年,他的团队用这种方法报道了第一种压电结构,从那以后,Xiao的团队、MacKinnon的团队和Patapoutian的团队相继推出了几个更高分辨率的版本。去年9月,Xiao又发布了一张Piezo2的图片,其尺寸和形状与Piezo1非常类似。Xiao的Piezo2图谱是迄今为止看到的三个叶片末端最清晰的图像,这些叶片通常四处移动,很难被显微镜捕获。

这些图像让人震惊。三种Piezo以三聚体的形式跨越质膜(图“压力感受器”)。从中心孔处,三个臂螺旋出来,像螺旋桨上的叶片。它们向上和向外弯曲,在细胞表面形成一个很深的凹陷。

Patapoutian和Xiao认为,当一个力撞击细胞膜时,叶片会移动通道内部的蛋白质“梁”,从而以某种方式将孔隙拉开。而MacKinnon则认为,Piezo的叶片不寻常的折叠方式暗示了一种不同的机制:如果推或拉增加了膜的张力,弯曲的通道可能会变平,打开孔隙。

这些假设还不能被验证,因为研究人员只能研究分离的Piezo,它们与细胞膜分离,处于封闭构象。拍一张细胞膜上Piezo打开的照片可以帮助科学家了解它的秘密。Patapoutian指出,他们想在自然环境中看到它。

几个实验室正在尝试对孔隙开放的压电通道进行成像。Patapoutian的团队正在使用一种能激活Piezo的化合物,并以《星球大战》中身材矮小、挥舞着原力的绿色绝地大师尤达的名字来给这种化合物命名(Yoda1)。Patapoutian希望,有了Yoda1的存在,Piezo1可能会打开孔隙,方便他们对其进行成像。他的另一个想法是将Piezo插入到名为纳米圆盘的人工膜上,因为这可能有助于稳定开放构象。与此同时,Xiao正在使用低温电子层析成像技术,这涉及到在不同的倾斜角度对样品进行成像,这可能有助于解析压电通道在天然或人工膜中的结构。

 

压力感受器

 

 

孔隙打开
 

 

痛点

在进行结构研究的同时,科学家发现Piezo在人体中扮演着不同的角色。

2014年,神经学家Alex Chesler刚刚加入位于贝塞斯达的国家补充与综合健康中心(National Center for Complementary and Integrative Health)。受Coste发现的启发,他创造了一种缺乏压电效应的小鼠来研究通道在触觉中的作用。后来有一天,他收到了同一栋楼里工作的Bonnemann的一封电子邮件,内容是关于那些缺乏本体感觉的女孩。

Chesler径直跑到楼上Bonnemann的办公室。他气喘吁吁地宣布:“你不知道你发现了什么。” Chesler不能直接询问缺乏压电通道的小鼠们的感觉,或者确切地说它们没有感觉——但他可以问这些小女孩。

他和Bonnemann邀请这些女孩去国家补充与综合健康中心接受更广泛的检查。这两个女孩都可以很好地控制自己的残疾,她们利用视觉帮助自己走直线或触摸目标。但是一旦蒙上眼睛,她们就难以控制自己的身体。同样,她们能感觉到音叉在皮肤上的振动,因为她们能听到。当戴着降噪耳机时,他们根本没有注意到震动。

Patapoutian在小鼠身上也发现了同样的现象:连接肌肉和肌腱的神经没有Piezo2,缺乏本体感觉,动作也不协调。他的团队还发现,在异痛症中,Piezo2在痛觉神经元中也有作用。异痛症是一种特殊类型的痛觉,即使是轻微的爱抚也会让人感觉像被针刺了一样。有些神经性疼痛患者一直都有这种过敏反应。

一般来说,小鼠在注射辣椒素(辣椒中发现的一种辛辣分子)或神经损伤后,会表现出异位性疼痛,但如果没有这种压电基因,则不会有这种反应。Chesler和Bönnemann报告指出,压电基因突变的人的痛觉也有类似的变化。

Swetha Murthy指出,慢性疼痛有这样一种使人衰弱的效果。他在Patapoutian实验室做博士后的期间主导了一项关于异痛的研究。Murthy认为他们可以开始寻找针对这些神经疾病的、以Piezo2为靶点的药物。Patapoutian和Chesler都在寻找一种化合物,这种化合物可以在不干扰蛋白质在全身其它功能的情况下,阻止疼痛部位的Piezo2的作用。Xiao表示,压电通道药物的潜力巨大。

不仅神经元需要感知触觉,几乎每个细胞都受到某种力的作用。以红细胞为例,它会变形,挤压微小的毛细血管。过度激活Piezo1的突变会导致血细胞萎缩,从而导致罕见的遗传性口形细胞增多症(一种由于阳离子通透性缺陷导致红细胞渗透脆性降低,导致红细胞脱水和轻度至中度代偿性溶血的贫血症)。

这些皱缩的血细胞让Patapoutian想起了镰状细胞贫血症。镰状细胞基因突变在许多非洲人身上持续存在,因为它可以预防疟疾,Patapoutian想知道这种Piezo1突变是否也能起到同样的作用。

如果是这样,非洲人后裔中发生这种突变的比例应该相对较高。数据库搜索显示,Patapoutian是正确的。事实上,在数据库中,三分之一的非洲血统的人都有一个特定的压电变体。一个独立的研究小组报告说,这种Piezo1突变的携带者对严重的疟疾有抵抗力。

根据Xiao的实验室的研究,Piezo1在骨骼形成和维持方面也有作用。当他的团队将小鼠成骨细胞(造骨细胞)中的Piezo1敲除后,小鼠比正常情况下长得更矮、更瘦。与对照组小鼠相比,支撑体重的长骨更轻、更薄、更弱。

此外,部分悬浮在空中的野生型小鼠——这样它们就不必支撑整个身体的重量——具有较低的压力蛋白表达和骨质量。Xiao指出,这种现象与骨质疏松症患者、卧床不起的人,以及国际空间站的宇航员很相似。

 

压力点

澳大利亚悉尼新南威尔士大学(University of New South Wales)的生物学家Kate Poole指出,尽管Piezo的发现是整个领域向前迈出的一大步,但很明显,这个故事不仅仅关于Piezo。

对听力感兴趣的科学家40年来一直在追踪相关的信息。马萨诸塞州波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital)的神经学家Jeffrey Holt指出,在这一过程中出现了很多错误的线索。现在他们认为,他们已经掌握了相当可靠的方法。

关键通道蛋白名为TMC1。Holt改变了TMC1中的氨基酸,这一过程改变了内耳细胞将机械信号转化为电子信号的能力。另一项研究表明,纯化的TMC1能够在人工膜泡中形成机械敏感离子通道。然而,TMC1的结构仍然是一个谜,因为该蛋白很难得到足够数量的纯化以获得良好的低温电子显微镜图像。

与此同时,Patapoutian的团队正在寻找全新的通道蛋白。2018年,他、Murthy和斯克里普斯研究所结构生物学家Andrew Ward报道了他们认为的可能是最大的机械激活通道群。他们了解到一种帮助植物感知渗透压的蛋白质家族——OSCA蛋白质——并推断它们可能更普遍地感知力。在人类肾脏细胞中,OSCA确实对Murthy研究中的细胞膜拉伸有反应。

研究人员还从以前的研究中得知,OSCA蛋白与哺乳动物中的另一种蛋白家族TMEM63蛋白密切相关。小鼠、人类,甚至果蝇的TMEM63通道在Murthy的实验中也对细胞膜拉伸做出了反应,所以OSCA和TMEM63蛋白质组成了一个庞大的力传感器家族,这对许多生物来说都很常见。

Murthy现在是波特兰俄勒冈健康与科学大学(Oregon Health & Science University)的生物物理学家和神经学家。他认为,肯定存在着更多的机械感测器。

Patapoutian表示,这些传感器的功能可能远比我们现在知道的要多得多。研究人员还只是接触到了皮毛而已。

OSCA通道是植物细胞中Piezo的近亲

OSCA通道是植物细胞中Piezo的近亲,可以感知渗透压。

 


原文检索:Amber Dance. (2020) Feel the force. Nature, 577: 158-160.
张洁/编译

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