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shRNA表达克隆

2. 疾病病程和肿瘤生长速率

Nov 29, 2010 No Comments

人体肿瘤的病程主要是以解剖学疾病分期(anatomical disease stage)和肿瘤的生长速度来决定的。临床上广泛使用的TNM分期主要是以肿瘤的大小(即T)、肿瘤扩散至局部淋巴结的数量(即N)以及是否有远隔转移(即M)来进行划分的。而患者的存活时间则是与病人体内肿瘤生长达到1kg大小时所需要的时间有关。肿瘤生长到这么大的时候人体也会出现各种器官功能衰竭甚至严重的系统性衰竭,最终死亡。肿瘤大小和肿瘤转移之间的关系以及与患者死亡之间的这种关系已经在多种肿瘤病例中得到了验证。比如患有T1N0M0期(即肿瘤直径小于2厘米,没有淋巴结转移,也没有远隔转移)乳腺癌的患者预后存活时间长达15年的患者比例高达90%,但是在T2N0M0期(即肿瘤直径介于2厘米~5厘米之间,没有淋巴结转移,也没有远隔转移)患者中这个比例就降到了70%。

我们可以通过放射影像(radiographic)的方法来了解人体肿瘤的生长速度,这实际上就是通过放射影像技术检测肿瘤的体积变化大小来了解肿瘤的体积倍增时间(tumour volume doubling time,TVDT)。因此,这种检测TVDT的方法是一种非创伤性的方法,而且该方法还涵盖到了能影响肿瘤生长动力学的多种因素,比如肿瘤增殖速率、新生血管形成、凋亡、坏死、机体免疫系统的作用等等。总体来说,TVDT时间是因人而异的(见图3c),但是原发灶肿瘤细胞与转移灶细胞的TVDT时间以及转移灶肿瘤细胞之间TVDT时间的差异实际上并不是太大。转移肿瘤的TVDT时间与原发灶肿瘤的TVDT时间是相当的,大约在60天至200天之间(表1),不过原发灶细胞的生长速度要比转移灶细胞快1倍。不幸的是,我们很少对成对样品(paired samples)进行过分析研究,但是就我们曾经进行过的配对研究来看,转移灶的生长速度都是与其原发灶生长速度差不多的。因此,至少在可检测的水平范围来看,不论肿瘤生长在何处,肿瘤细胞的生长速度是一种能反映肿瘤“起源”的固有特性。这一结论已经得到了好几个独立开展的组织学研究的证实,这些研究中使用了有丝分裂指数(mitotic index)方法或者Ki-67抗原循环细胞计数方法来检测肿瘤细胞的增殖指数(proliferation index),通过增殖指数来比较不同肿瘤细胞的生长速度(表1)。结果发现,转移灶肿瘤细胞的增殖指数与原发灶肿瘤细胞的增殖指数非常接近(图3d和表1)。虽然上述这些方法没有将消亡速度(attrition rate)考虑在内,但也可以近似地认为它们代表了TVDT时间。

TVDT时间是以直接检测并估计肿瘤生长的持续时间(即肿瘤的“年龄”)来判断的。一般认为肿瘤会持续以指数级别的速度生长(图3a)。但是当肿瘤生长到一定大小的时候,它们的生长曲线会进入平台期,见图3b所示的S型生长曲线。肿瘤细胞在最开始时生长速度很快,随着肿瘤体积的增大,所需的营养物质越来越多,当营养供应不充足时肿瘤的生长速度就会逐渐减缓下来。在用于筛查乳腺癌患者TVDT时间的乳腺X光摄影检查术(mammography)中,该方法的检测阈值可以达到10~14毫米以下,此时的肿瘤灶还非常小,但是它们的生长速度却很快。因此不能用平台期的数据来决定TVDT时间,而应该用指数生长期的数据来表示TVDT时间。此外,关于肿瘤细胞一直会以指数级生长速度进行增殖的理论也得到了证实,有人用大量患者从转移灶被发现至死亡这一段时间的数据验证了上述理论。在乳腺癌患者群体中,患者从确诊发现转移灶到死亡的这一段生存时间只取决于两个因素,但是该生存时间与确诊时的原发灶大小无关,这就说明肿瘤细胞的生长速度在原发灶被确诊之前就是没有区别的。据估计,从肿瘤开始发生转移至转移灶被确诊之间差不多有6年时间。虽然上面介绍的实验方法可能过于简单,但是它们得出的结论却都惊人的一致。不论是线性转移机制还是平行转移机制都必须能够对肿瘤病程的发展做出解释,包括要能对转移灶肿瘤细胞的生长速度很少能够比原发灶肿瘤细胞的生长速度快超过1倍的现象做出解释。

 表1 人体肿瘤及其转移灶的生长速度和增殖指数

表1 人体肿瘤及其转移灶的生长速度和增殖指数

 

人体肿瘤细胞的生长速度

图3 人体肿瘤细胞的生长速度。a:图中显示了肿瘤体积大小与细胞以指数增长方式倍增之间的关系;b:在肿瘤可见期,肿瘤的生长最开始是以指数增长方式进行的,但是随着肿瘤体积的增大,其生长速度会逐渐减缓,此即Gompertzian生长曲线,但是在肿瘤的不可见期,其生长速度就各异了,可快可慢。大多数研究者都倾向于肿瘤细胞是以图中红线所示的持续指数生长模式生长的;c:图示12个乳腺癌原发灶细胞的生长速度。其中每一条曲线代表一个细胞的生长情况。实线表示肿瘤进入可见期,虚线表示不可见期;d:图示8名患者中同一患者体内导管内区域(即原发灶区域)、浸润区域和转移灶区域的增殖指数(以Ki-67标记法检测)。从图中可以看出四名患者的转移灶增殖指数较高,而另四名患者的转移灶增殖指数较低。

 

2.1 线性转移模型
肿瘤灶的体积大小与肿瘤转移情况之间的这种关系好像非常符合线性转移模型的理论。在前文所列举的例子当中,身患T2期肿瘤患者的死亡率要比T1期患者的高出20%,这可能是因为肿瘤原发灶在从2厘米大小生长到5厘米大小的期间有更多的肿瘤细胞具有了转移的能力。如果在原发灶还不到2厘米的时候就手术清除掉癌灶,这样就可以抑制肿瘤的进一步发展,也可以防止肿瘤细胞从原发灶处脱离并转移。

我们已经对大范围乳腺癌患者采用乳房X线照相术进行了广泛的研究,已经基本弄清楚了乳腺癌细胞的生长速率。在年轻女性患者体内的原发灶肿瘤细胞的生长速度要比老年女性患者体内的原发灶肿瘤细胞快得多。在60岁老年妇女体内,肿瘤细胞的TVDT时间是157天(表1)。这也就是说肿瘤细胞需要花费12年的时间才能生长成直径约1厘米的原发灶,然后只需要3年时间就可以从直径约1.4厘米大小的T1期肿瘤生长到直径达到7厘米的大肿瘤。在线性转移模型中,可能会有肿瘤细胞在手术治疗之前就已经从原发灶处脱落,这些细胞就是导致患者在6至12年之后癌症复发的罪魁祸首。不过这一观点与临床上观察到的实际情况有所出入。在临床上我们发现,从手术切除至发现转移灶可能只有35个月(T1期患者)至20个月(T3期患者)不等。因此造成这些转移灶的肿瘤细胞,它们的生长速度(30个月里倍增30次)至少要比原发灶处肿瘤细胞(12年里倍增30次)快5倍。

不过有两种非常常见的现象用线性转移模型还无法获得完满的解释,这两种现象之一是我们在临床实践工作中,通常在癌症早期,即T1M1期或T2M1期就可以发现肿瘤转移现象;其二,有时我们根本就无法找到肿瘤的原发灶。在美国以及欧洲患有T1期和T2期乳腺癌的患者人群中,有5%的患者在确诊患有乳腺癌时就已经发现同时存在转移情况了,还有5%~10%的患者根本无法找到原发灶。在这些情况下,如果按照线性转移模型理论,转移灶的生长速率应该是比原发灶快得多才对,但是我们没有发现任何证据能够支持这一观点。

2.2 平行转移模型
事实上,肿瘤原发灶细胞和转移灶处细胞的生长动力学情况非常符合平行转移模型理论。如果原发灶肿瘤在12年里生长成了直径达1厘米的肿瘤灶,那么转移灶肿瘤病灶要达到这样的大小也得需要6至12年的时间。平行转移模型就非常符合我们在临床上观察到的这种实际现象(图2)。

不过,平行转移模型还必须能够解释肿瘤原发灶的大小与肿瘤发生早期转移现象以及发生早期转移事件可能性(频率)大小之间的关系。在发现“大型(相对“小型”而言)”原发肿瘤病灶之后能够较早发现转移灶的这种现象,我们可以用前置时间效应(lead time effect)来进行解释,所谓前置时间指的就是相比小体积病灶所需的生长时间,要生长成较大体积肿瘤病灶所需要的那一部分额外时间。比如我们在前文中提到的,肿瘤病灶生长到直径7厘米大小所需要的时间相比生长到直径仅有1.4厘米大小所需要的时间要多出3年。因此,在较大原发灶患者体内发现转移灶的几率相比来说就要大得多,因为按照平行转移理论,T3期原发灶的转移灶要比较小原发灶的转移灶的生长时间多出3年,因此它们长得更大,也就更容易被发现。

但是,如果肿瘤细胞最初开始从原发灶处脱落并播散就是开始于我们还无法检测到的阶段,那么为什么用手术切除T1期患者的肿瘤相比切除T2期肿瘤能够提高20%的存活率呢?有一种还未经过验证的理论认为,原发灶肿瘤的某种信号能够促进转移灶肿瘤的生长。如果这些信号能够解释原发灶大小与肿瘤转移之间的关系,那么这些刺激信号的强度也应该与原发灶的大小有关。这些刺激信号能够诱导生长因子以及那些具有能够促进肿瘤间质重构、调整间质细胞功能和活性、间接促进转移肿瘤细胞在转移灶处生长等功能的细胞因子的分泌。

 

 

3. 肿瘤转移模型的遗传学证据
晚期肿瘤细胞的选择作用和晚期克隆性扩增作用(late­stage clonal expansion)会先于转移现象而发生,这是线性转移模型的中心理念。但是在平行转移模型中则认为,在肿瘤发展过程的早期,那些还没有积累到足够突变的肿瘤细胞就已经脱离并散播出去了。在患者体内,形成转移灶的“原始”细胞都来自DTC细胞群,这也就意味着会有一个或几个DTC细胞最终“胜出”。因此,我们可以通过对DTC细胞和转移灶细胞进行的遗传分析来对上述两种转移模型进行评判。

根据Schlimok和Riethmüller进行的一项开拓性研究发现,可以在M1期或M0期患者体内的包括骨髓(bone marrow)、淋巴结(lymph node)等间充质器官(mesenchymal organs)中发现DTC细胞。我们可以用诸如上皮细胞角蛋白(epithelial cytokeratins)或上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EPCAM,又名TACSTD1)等上皮细胞分子标志物来发现DTC细胞,这说明DTC细胞是一种非常少见的细胞。使用相同的发现DTC细胞的方法,不论针对哪种肿瘤患者,在大约30%的M0期患者中,平均在每200万个骨髓细胞中才能发现1~10个DTC细胞。而且,如果在患有上皮细胞来源肿瘤的患者体内发现了上皮细胞角蛋白呈阳性的DTC细胞,则预示着该患者的预后较差,这说明DTC细胞与疾病的发展有关。

直到单细胞全基因组分析技术的出现,我们才有可能对尚未形成转移灶的DTC细胞进行分子层面的分析。我们对所选取的肿瘤患者骨髓细胞样品中的DTC细胞以及各自的原发灶细胞进行了对比。我们统一在手术前提取这些细胞样品,这样就保证了所有的样品都是取自疾病发展的同一阶段。让我们吃惊的是,在对乳腺癌、前列腺癌和食管癌患者的样品进行比对后发现,它们的骨髓DTC细胞之间的遗传差异性(genetic aberrations)要比原发灶细胞之间的差异小得多。使用细胞分裂中期细胞比较基因组杂交方法(comparative genomic hybridization,CGH)我们发现,在乳腺癌样品中,有50%的上皮细胞角蛋白呈阳性的DTC细胞显示核型正常,但是所有的原发灶肿瘤细胞都显示核型异常。虽然有些DTC细胞显示的核型正常,但是它们仍然含有一些小的,亚染色体层面的缺失现象,这种现象在乳腺癌DTC细胞中尤其明显。这一现象证实了转移灶细胞的确是在它们尚未完全恶性变之前就已经脱离了原发灶这一观点。在乳腺癌原发灶肿瘤细胞中最常见的染色体异常情况,比如8q染色体增多和13q、16q和17p缺失等以及在前列腺癌原发灶肿瘤细胞中最常见的染色体异常情况,比如8p染色体缺失、8q染色体增多与13q、16q缺失等都很少见于DTC细胞,哪怕是在核型异常的DTC细胞中也不常见,但是可见其它类型的异常。多个对照试验都证实了上述结论的可靠性。

在食管癌细胞中,多种异质性染色体重排现象既可见于原发灶细胞也可见于DTC细胞,这说明适应性选择(adaptive selection)机制在转移灶细胞获得对转移灶局部微环境的适应能力以及生长能力过程中起到了重要作用。不过这也并不排除其它机制发挥作用的可能性。虽然ERBB2基因扩增现象并不是来源于淋巴结和骨髓组织中的DTC细胞中最常见的染色体异常现象,在原发灶细胞中ERBB2基因的扩增或缺失都与DTC细胞中的ERBB2基因状态无关。原发灶肿瘤细胞的ERBB2基因扩增现象与患者的存活率无关,但是如果DTC细胞中出现ERBB2基因扩增现象,患者的生存期都不会超过23个月。

不过在这类肿瘤患者体内,只有DTC细胞或T3、T4期原发灶细胞中ERBB2基因的扩增状态能预示患者的预后情况。这一发现具有重要的价值。首先,DTC细胞从原发灶处脱离下来之后才会表现出ERBB2基因扩增现象。其次,DTC细胞从原发灶处脱离之后,原发灶细胞中的ERBB2基因会出现扩增,不过这些后来出现的ERBB2基因阳性原发灶肿瘤细胞并不一定会散播出去。最后,在对一些原发灶细胞与相应DTC细胞进行的配对研究中发现,ERBB2基因在这两种细胞中相对对立的扩增情况以及这两种ERBB2基因阳性细胞对判断患者预后情况的价值差别都表明ERBB2基因对于DTC细胞来说更为重要。

除了上述这些DTC细胞与其原发灶细胞之间的比对数据之外,还有一些比对数据能够支持或反对线性或平行转移模型。线性转移模型认为原发灶细胞与转移细胞之间存在一种重叠关系,而平行转移模型则认为,原发灶细胞与转移细胞之间是相互独立的,是各不相同的。

只有来自同一患者的比对数据才有意义,但是这样的数据太少了。不过我们还是在各个分子层面上发现了高度的多样性情况。比如在结肠癌患者体内,KRAS基因突变在原发灶细胞中的情况与在转移灶细胞中的情况就要相差高达50%,而在肺癌人群中这种差异更是高达75%至80%。同时,在肺癌患者人群中,有75%的人也表现出EGFR基因的突变多样性情况(外显子18~21突变)。在对来自26名患者的146份样品的52个微卫星位点(microsatellite marker)等位基因不平衡(allelic imbalance, AI)现象的详细检测中我们发现,在原发灶细胞中出现等位基因不平衡现象的比例要比转移灶细胞中高出很多。这种在等位基因不平衡现象中表现出来的高度不一致情况不仅存在于原发灶与转移灶之间,同时还存在于同一患者体内不同的转移灶之间。有很多科研小组都用诸如CGH这种全基因组分析方法进行过研究,结果发现有更多的遗传变异情况在原发灶与转移灶等不同肿瘤细胞中都表现出差异性。最后,我们还发现,在人体内往往共同存在着好几种来源于遗传学上互无关联的原发肿瘤细胞克隆的转移灶细胞,这说明有很多原发灶肿瘤细胞其实也不是来源于同一“原始”细胞的。不过虽然大多数的研究都证实了源自同一患者体内的原发灶细胞与转移灶细胞之间的这种基因突变上的差异性,但是还是有少数研究发现了能印证线性转移理论的基因突变方面的重叠现象。

全基因表达谱研究方法(Global gene expression profile)在比对来自同一患者的原发灶细胞与转移灶细胞时要比比对来自不同患者的原发灶样本或转移灶样本更为适合。不过,这种比对方法忽略了不同遗传背景对基因表达的影响作用,很明显,来自同一患者的样品要比来自不同患者的样品在遗传背景上更为相似。另外,如果原发灶肿瘤细胞和转移灶细胞都能够影响或改变各自的生存微环境以适应肿瘤的生长需要,那么它们的表达谱就有可能会比较一致。因此,用研究基因表达谱的方法来判断不同肿瘤细胞(原发灶与转移灶或转移灶之间)之间的关系可能并不是一个最好的办法。

3.1 线性转移模型
根据前文所述,在对原发灶肿瘤细胞与转移灶肿瘤细胞的遗传学分析中我们发现,线性转移模型并不正确。不过出乎意料的是,我们所认为的完全恶性肿瘤细胞(fully malignant tumour cells)或晚期肿瘤细胞却表现出了与那些极少会脱离原发灶进入骨髓或淋巴结中的原发灶细胞非常不同的遗传特性。不过这也可能是由于实验误差或某些人为因素所造成的假象。我们是根据细胞是否表达细胞角蛋白8(cytokeratin 8)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19)或EPCAM分子这些在原发灶细胞中大量表达的分子标志物来判断肿瘤细胞是否是原发灶细胞的。实验结果并没有排除存在不表达细胞角蛋白8(cytokeratin 8)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19)或EPCAM分子等细胞标志物DTC细胞的可能性。这些细胞标志物阴性的肿瘤细胞可能具有与细胞标志物阳性的DTC肿瘤细胞所不同的基因变异现象,但是这些基因变异现象可能是原发灶细胞所具有的。但是在线性转移模型里不能没有这些细胞标志物阴性的DTC细胞。

在原发灶细胞与转移灶细胞间出现的这种在基因突变方面表现出来的高度的不一致性很难用线性转移模型进行解释。即使是最好的情况也只能说明原发灶细胞与转移灶细胞之间所表现出来的遗传差异性可能也就说明了在原发灶中有一些未被我们发现的肿瘤克隆形成了转移灶,但即便如此,线性转移模型也还需要进行很大的修改才行。

3.2 平行转移模型
上面列举的种种数据都说明肿瘤细胞的散播并不是在肿瘤发展到晚期才发生的事件。于是问题出现了,肿瘤细胞是在什么时候就开始散播的呢?在用小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumour virus,MMTV)MMTV–Erbb2和MMTv–PyMT构建的能自发形成乳腺癌的转基因小鼠动物模型中,早在原发灶发展成形态学上呈现侵袭性之前就已经可以在小鼠的骨髓与肺组织中发现DTC细胞了。使用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy)发现,早在不具侵袭性的非典型性增生(atypical hyperplasia)阶段,就已经有细胞开始侵入、突破基底膜了。随后又在患有非侵袭性的原位管癌(ductal carcinoma in situ)患者骨髓组织样品中发现了细胞角蛋白呈阳性的细胞,这进一步证实了我们在人乳腺癌小鼠动物模型中观察到的现象,也证实了肿瘤细胞是在早期就开始从原发灶处脱离并播散出去的理论。

因为肿瘤细胞会一直进行“进化”,也会因为各自所处的微环境的不同而承受不同的选择压力,这就是早期转移理论能够支持原发灶肿瘤细胞与转移灶细胞之间存在差异性的原因,但是早期转移理论该如何解释原发灶肿瘤细胞与转移灶细胞之间的相似性呢?这种差异性不仅源自前文所述的种种原因,还取决于DTC细胞从原发灶处“继承”了何种突变,以及这些突变在何种程度上限制了转移灶祖细胞的突变范围。不过人体肿瘤细胞的突变范围很有限,因此选择压力对肿瘤细胞造成的影响可能会是一样的。比如BRAF基因都在第600位密码子处发生突变,KRAS基因都在第12、13或61位密码子处发生突变,而80%的PI3K基因主要都在3个突变热点地区发生突变。同样,染色体异常情况也不是随机的。对22种癌症细胞的约6000个CGH数据进行分析后只发现了下列几种突变情况,即+1q、+3q、+7、+8q、–13q、–17p、–18q以及+20q。值得注意的是这些突变类型几乎见于各种类型的肿瘤以及各类患者人群中。这种非随机性突变现象提示我们,可能有一种基因损伤机制可以在同一肿瘤患者体内各个不同的病灶部位各自独立的发挥作用。

但是,遗传突变范围的限制理论却不足以解释原发灶细胞与转移灶细胞之间的差异,这种差异性说明环境压力对肿瘤细胞具有选择作用。有很多能影响肿瘤增殖、细胞起源以及细胞所处微环境的因素都是原发灶位点与转移灶位点所共有的,因此原发灶细胞与转移灶细胞之间的相似性可能也反映了一种趋同进化(convergent evolution)的现象。

 

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