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shRNA表达克隆

用活细胞做试管

Feb 26, 2010 No Comments

利用几种特殊探针和先进的光学显微镜,我们现在可以把活细胞当做试管,在活细胞内定量研究生化反应。借助一些特殊的系统,我们可以在单分子水平,以纳米级的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率来发现并跟踪研究某些蛋白质分子。比如可以通过相干反斯托克斯-拉曼散射显微镜(coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy)对活细胞中通常难以发现的代谢产物分子(Metabolites)进行跟踪观察和采集图像。本文中我们将详细介绍如何使用这种新方法对基因表达、主动转运和脂质代谢等领域进行研究。

我们对于细胞内大部分分子水平生化反应的定量研究成果都来自于传统的生物化学方法,即用各种纯化的生物分子在试管内进行试验的方法。虽然我们用生化方法获得了大量的研究成果,但是我们知道,细胞内的真实环境和试管中的环境还是有很大差异的,这些区别表现在以下几个方面:
(i)在细胞中有很多DNA分子、mRNA分子以及酶类分子的“拷贝数”都是很低的,这些“少见”的分子会参与一些反应,但是由于在试管中大量其它分子的存在,这类反应是不会进行或者不可能被我们检测到的;
(ii)细胞中的生化反应通常都是处于非动态平衡的稳定状态,具有持续不断的自由能及反应物供给;
(iii)在细胞中很多反应都是配对的,各种反应之间能构成复杂的生化反应网络系统。

因此,在细胞内进行的生化反应可能会有与试管中进行的生化反应不同的热力学参数和动力学参数。现在面临的问题是如何才能观察到活细胞内发生的生化反应,幸好我们现在有了新方法,能够在某些系统中对活细胞进行观察了。这些新技术中的核心技术就是光学成像技术,该技术达到了毫秒级的时间分辨率和纳米级的空间分辨率,能在单分子水平进行观察,而且更加重要的是,该技术具有生化反应特异性。在此,我们将就该技术在活细胞内的基因表达、主动转运以及新陈代谢等研究领域的应用价值进行详细介绍。

在单个的细胞中,基因表达实际上就是一个单分子问题(single-molecule problem)。在细胞基因组中,通常的基因都只会有1个拷贝或者几个拷贝,这些基因会根据细胞生化功能的需要被打开(转录表达)或关闭(不转录表达)。过去我们都用Northern blotting、Western blotting或者PCR法来检测基因是否有表达。后来又出现了DNA芯片和质谱检测技术。不过所有这些技术都不够敏感,不足以对低表达水平的基因进行单分子水平的检测。而且这些整体平均式的(ensemble-averaged)方法经常会掩盖一些随机发生的(stochastic)基因表达事件。体外单分子试验方法为我们研究基因表达机制提供了非常有价值的帮助。下一步,就是将单分子研究技术的应用范围拓展到活体细胞内了。

由于两项技术的进步,使得我们得以能够在单分子水平对活体细胞内的基因表达情况进行研究。由于有了多拷贝荧光mRNA结合蛋白(fluorescent mRNA binding protein),我们得以在转录水平发现单个的mRNA分子,并对它们进行跟踪观察。而在翻译水平,我们借助快速成熟的膜靶向的黄色荧光蛋白(YFP)作为探针,从而对单个的蛋白分子进行跟踪观察。

由于YFP蛋白可以固定到细胞膜上,这就克服了过去不能检测胞浆中单分子蛋白质的难题。也克服了在一段图像采集时间内,因为蛋白在细胞内的快速移动导致荧光信号广泛散布在细胞内,进而被细胞的自发荧光给湮没掉的难题。我们用该方法监测了大肠杆菌细胞内lac启动子被抑制后的蛋白表达情况(图1A),发现了基因短暂的突然表达现象(图1B),每一次表达都源自结合在mRNA分子上的核糖体。每一次突然的蛋白表达获得的蛋白分子数都成几何分布,这种现象已经被好几种不同的探针分子给证实了。这种方法为我们提供了有关基因表达过程中随机波动现象的详细数据。

有没有一种办法能发现胞浆内的单分子蛋白质分子?答案是肯定的。我们借鉴了频闪摄影术(strobe photography)的方法。使用频闪摄影术可以拍摄到子弹穿过苹果的清晰图像(图1C),这是因为光线闪烁的频率非常快,在一次闪烁的时间内,子弹不可能移动太多的距离。我们也使用了这种策略,用强激光照射细胞,不过每次照射的时间非常短,只有大约300微秒,在这么短的时间内,蛋白质分子也同样不可能移动得太远。图1D展示的是在大肠杆菌胞质内拍摄到的高信噪比红色荧光蛋白图像。使用这种方法还可以不经过校准就对细胞内低表达水平的蛋白浓度进行检测。不过要更好的利用这种技术,还需要更容易控制其光化学性和更高光稳定性的探针分子。

活体大肠杆菌细胞内蛋白质表达成像

Promoter:启动子;repressor:抑制物;tsr:tsr基因;venus:venus基因;RNAP:RNA聚合酶;chromosome:染色体;ribosome:核糖体;polypeptide:多肽链;Inner membrane:胞内侧细胞膜;outer  membrane:胞外侧细胞膜;Number of protein molecules:蛋白质分子的数目;time(min):时间(分钟);Intensty(a.u.):强度(任意单位);distance(μm):距离(微米);
图1 活体大肠杆菌细胞内蛋白质表达成像。A:当抑制物从lac启动子上解离下来之后,RNA聚合酶催化Tsr-Venus融合基因转录成mRNA,核糖体与mRNA结合,翻译表达出融合蛋白分子。Tsr蛋白是一种快速成熟黄色荧光蛋白,它将Venus蛋白锚定在细胞膜上,这样就可以一次只观察一个Venus蛋白分子;B:在三个细胞系中(图片右侧)Tsr-Venus融合蛋白随时间表达情况图(左侧)。图片经过100毫秒曝光后,随即经历1000毫秒光漂白作用。每隔3分钟记录一次图像,最后一次采图后计数蛋白合成的分子数。图中虚线表示细胞分裂;C:图示子弹穿过苹果的瞬间,使用频闪摄影术(strobe photography)拍摄的该幅照片;D:荧光/DIC重叠法大肠杆菌成像图片,图中两个大肠杆菌细胞内分别含有一个tdTomato分子。荧光图像是经短时(300微妙)高强度(50千瓦/厘米2)的激光激发后拍摄的;E:沿图(D)中所示虚线测得的荧光强度图。图中出现了两个峰,这两个峰就是tdTomato分子所致。

下一个目标就是使用不同颜色的探针分子同时跟踪观察多个不同的基因表达情况,以此来研究基因间的相互作用。类似的活细胞单分子检测技术除了能用于基因转录和翻译研究之外,还能够用于其它的细胞研究领域,比如细胞信号通路、蛋白质折叠、DNA复制以及RNA运输等等。

在活体细胞内,与基因表达同样重要的问题就是能量转移(energy transduction)问题。运动蛋白(Motor proteins)能将细胞内以ATP形式储存的化学能量转换成机械功。驱动蛋白(Kinesin Motor)和动力蛋白(dynein motors)能驱动细胞器沿着微管(microtubules)移动。我们已经在体外试验中对这种动力蛋白单分子层面的作用机制有了很深入的了解,但是对它们的体内作用机制却几乎是一无所知。

去年,有两个研究小组报告,他们在活体细胞内使用高灵敏度的高速照相机,以纳米级的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率捕捉到了动力蛋白分子发挥作用的好几个步骤。该技术中的关键是,即使由于衍射现象产生了直径约270纳米的荧光光斑,也可以借助纳米级的空间分辨力找出光斑的圆心位置,获得足够亮的图像。这种方法最开始是应用在体外研究动力蛋白作用机制的实验当中的。不过由于在体内试验中,细胞内的ATP浓度要比体外实验中高得多,因此动力蛋白的运动速度也要快很多,这就对实验技术的时间分辨率提出了更高的要求。

在我们实验室里,Nan科研小组在解析动力蛋白一个个单独的纳米级工作步骤时,通过追踪含有量子点(QD)的胞内小泡(endocytic vesicles)的运动,获得了亚毫秒级的时间分辨率。量子点的亮度非常高,经过胞吞作用(endocytosis)被小鼠成纤维细胞摄入之后,这些含有量子点的小泡就会沿着微管移动(图2A)。每当有一次ATP分子水解,小泡就会移动8纳米(图2B)。这也印证了图2C中显示的距离为8纳米的配对相关函数(pairwise correlation function)。我们可以沿着胞内微管观察到含有量子点的胞吞小泡以这种分段式的方式进行双向移动,有些小泡一步的距离可能会超过8纳米,而有一些小泡可能不够8纳米。这种现象引发了一个有趣的问题,在活体细胞内有多少种动力蛋白,有多少个动力蛋白在同时工作?这种活体细胞的实验方法能获得动态的数据,因此如果能用于类似体外实验那样的动力蛋白研究,是会取得研究成果的。

大部分代谢产物与进行标记后不会改变其功能的蛋白质不同,这些代谢产物都是小分子有机物,很难在不改变其细胞学功能的前提下对它们进行标记。此时拉曼散射(Raman scattering)现象就派上了用场,因为用拉曼散射方法不需要对代谢产物进行外源性标记,可以对分子内在的震动频率(vibrational frequencies)进行检测。比如有两种脂肪酸(EPA和OA)的拉曼光谱峰就完全不同,这是由于两种脂肪酸各自酰基(acyl-chains)中所含的–CH2基团和–CD2基团发生的伸缩振动(stretching vibrations)不同造成的(图3A)。

 
不过对于活细胞来说,拉曼散射信号实在是太弱了,如果要得到有用的图像,必须用很强的能量去激发,而且还需要长达好几个小时的图像采集时间。相干反斯托克斯-拉曼散射显微镜(CARS)对于活体细胞成像和动物成像来说是一种非侵入性的方法,相干反斯托克斯-拉曼散射显微镜技术能产生对比振动信号(vibrational contrast),该技术的灵敏度要比传统拉曼散射显微镜高好几个数量级。相干反斯托克斯-拉曼散射显微镜技术使用两束在时间上和线性上互相重叠的,频率不同的皮秒级激光光波ωp和ωs,将这两束激光都聚焦到样品上。当ωp-ωs的频率与待测分子的振动频率相匹配的时候,会激发分子振动,产生反斯托克斯频率的2ωp-ωs共振增强CARS信号(resonance-enhanced CARS signal)。CARS信号只在激光汇聚时产生,允许类似双光子荧光显微镜(two-photon fluorescence microscopy)那样的三维分割(three-dimensional sectioning)。虽然CARS显微镜不具备MRI那样的成像深度,但它具有优于MRI技术的时间及空间分辨率,而这恰恰是活体细胞成像最需要的。CARS显微镜对于含有大量CH基团的脂质分子成像效果最佳,因此最适合用于研究脂质代谢。

接下来我们将用监测鱼油(fish oil)是如何影响细胞脂肪分子的实验来展示CARS显微镜的应用价值。我们早就知道,像存在于鱼油中的EPA这样的多不饱和脂肪酸类物质能够降低我们人体内甘油三酯的水平。正是出于这个原因,FDA在2004年专门向公众介绍了服用鱼油的好处,食用鱼油可以避免罹患诸如心血管疾病之类的与高血脂有关的疾病。

利用细胞内吞量子点跟踪观察活体细胞内微管运动步骤

nucleus:细胞核;membrane:细胞膜;displacement(nm):移动距离(纳米);plus-end:正极;       time(s):时间(秒);occurrence:发生率;pairwise distance(nm):配对距离(纳米);
图2 利用细胞内吞量子点跟踪观察活体细胞内微管运动步骤。A:A549活体细胞内含有蓝色亮点所示的内吞量子点,这些量子点主要由驱动蛋白负责移出细胞,由动力蛋白负责移入细胞,如图中白色箭头所示;B:内吞量子点外向(即朝向微管正极方向)迁移轨迹,该轨迹显示量子点是逐步外迁的。图中绿色显示的是原始数据,红色表示优化处理后的数据;C:将(B)中的红色数据处理后制成配对距离直方图,图中可见每一个峰之间的距离是8纳米。

为了能将普通脂肪酸,比如油酸(OA)与EPA区分开来,我们使用了氘化的OA(deuterated OA)。这种方法有点类似于传统的研究代谢途径的同位素示踪方法(isotope tracking)。氘化剂导致振动频率发生了迁移,从–CH2 基团的2850 /厘米变成了–CD2 基团的2105/厘米(图3A)。我们发现,在含有普通EPA和氘化OA的培养基中生长的细胞里,这两种脂肪酸以甘油三酯(triglycerides)的形式共同存在于细胞溶酶体中(图3B至F)。但是在没有EPA存在的情况下,OA则不会进入细胞溶酶体内。这为我们了解鱼油的保健功能提供了一个很好的实验方法。将来,将报告蛋白荧光图像与CARS显微镜图像结合起来,我们必将对该代谢途径有更深入的了解。

目前,CARS显微镜在激光聚焦部位的灵敏度为105振动频率(vibrational oscillators)。我们正在努力提高CARS显微镜的灵敏度,使其能够用于检测低浓度的小分子物质,比如药物分子等。

新型的单分子成像技术和代谢成像技术如果与信息那个的探针以及细胞试验技术相结合,就能够提供非常强大的体内试验方法,帮助我们解决各种生化难题。随着我们对这些新技术不断的进行发展、改进以及不断的实验,我们必定能对活体细胞内的生化反应过程有着更多的了解。

 

用CARS显微镜对代谢过程进行成像监测的方法来研究鱼油对脂肪代谢的作用

Eicosapentaenoic acid:二十碳五烯酸(即EPA);Deuterated oleic acid:氘化油酸;
Wavenumbers (cm–1):每厘米的波数;       
图3 用CARS显微镜对代谢过程进行成像监测的方法来研究鱼油对脂肪代谢的作用。A:EPA和氘化油酸的拉曼光谱;B:至(F)用0.4mM的EPA和0.2mM的氘化油酸处理活体肝细胞7.5小时之后,用单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine)标记,单丹磺酰戊二胺可以对降解细胞器进行染色;B:–CD2 基团的CARS图像,图中蓝色示氘化油酸; C:–CH2 基团的CARS图像,图中红色示EPA;D:–CD2 基团和–CH2 基团的重叠图像,如图中紫色所示。图中绿色所示的是单丹磺酰戊二胺荧光图像;E、F细胞中甘油三酯含量丰富区域的局部放大图,从图中可以发现–CD2 基团和–CH2 基团共同定位于降解细胞器中,即图中绿色区域中箭头所指区域。

 

原文检索:
X. Sunney Xie, Ji Yu, Wei Yuan Yang. Living Cells as Test Tubes. Science, 312:228-230.

筱玥/编译

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