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shRNA表达克隆

深度解密星形胶质细胞的隐秘功能

Nov 06, 2018 No Comments

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人们使用免疫抗体包被筛选法(immunopanning)的技术来研究大鼠幼崽的星形胶质细胞。

 


随着可用工具的增加,科学家发现星形胶质细胞不仅是“神经胶水”,还具有复杂的功能。

在19世纪50年代中期,德国解剖学家Rudolf Virchow等人在显微镜下观察到,大脑中某种神秘结构紧紧包围着神经元。 Virchow将这些结构称为nervenkitt,字面意思是“神经胶水”,并翻译成“neuroglia”。

现在,虽然研究人员知道,nervenkitt主要是星形胶质细胞,占哺乳动物大脑中所有细胞的20-40%,然而几十年来,这些细胞的作用仍然像Virchow第一次看到这些结构时一样神秘。

与神经元不同,星形胶质细胞不传导电冲动,因此传统的电生理学方法无法检测到它们的活性。它们也非常复杂:单个星形胶质细胞可以连接成千上万个神经元。

正如加州大学洛杉矶分校(University of California, Los Angeles, UCLA)的神经科学家Baljit Khakh所说,我们还没有一套能够在整个大脑中特异性地、可靠地探测这些细胞的工具。

Khakh和全世界越来越多的研究人员开始不再以神经元为焦点,而是深入研究星形胶质细胞的功能。他们正在开发新技术,以将星形胶质细胞分类为具有不同作用的亚型,并揭示星形胶质细胞如何支持和塑造神经回路。这些工具甚至可以帮助研究人员设计治疗脑疾病的策略。

 

雪花状结构

纽约大学(New York University)神经科学家Shane Liddelow指出,通过抗体染色并在显微镜下观察,可见星形胶质细胞像自行车车轮一样——一个大的中央细胞体,有六个较厚的分支向外辐射。但是当用荧光染料注射单个细胞时,能够看到更多的结构。Khakh表示,这些“分支”形成更精细的结构,就像3D雪片一样。“雪片”环绕着大脑中的每个突触,并且一些精细分支具有球状末端,包围着血管,在脑组织和脉管系统之间形成保护区。

一个多世纪以来,科学家一直认为,星形胶质细胞仅仅作为支持细胞,但事实上,它们在大脑中起着至关重要的作用。研究人员正在探索这些不同的功能(包括分选)和培养星形胶质细胞的方法,以及开发追踪这些细胞在神经回路中起作用的基因传递工具和光学技术。利用新技术,科学家发现,星形胶质细胞通过调节其代谢活动,控制神经递质水平、调节细胞外钾离子,从而影响神经细胞放电的阈值,并释放促进突触形成和修剪的分子。Khakh指出,星形胶质细胞是“主要的脑内稳压器”。

其实早在大约10年前,Benjamin Deneen等人就发现了星形胶质细胞功能多样性的早期线索,当时他在加州理工学院(California Institute of Technology, Caltech)做博士后。他和他的同事当时正在分析小鸡和小鼠的脊髓组织,结果发现星形胶质细胞表现出空间模式。也就是说,名为转录因子的DNA结合调节蛋白的区域组合决定何时产生星形胶质细胞亚型和产生哪种星形胶质细胞亚型。

这让Deneen对大脑的异质性产生了强烈的好奇心。问题是,在脊髓中这种模式定义很明确,但每个大脑区域的规则似乎都不一样。

现任德克萨斯州休斯顿贝勒医学院实验室(Baylor College of Medicine)主任的Deneen开始使用荧光激活细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)来研究星形胶质细胞。在经过遗传修饰的小鼠中,使用该技术让星形胶质细胞特异性表达绿色荧光蛋白,然后根据细胞表面蛋白的表达将星形胶质细胞细分为五个不同,但有所重叠的亚群。然后研究人员使用RNA测序来确定每个亚群的分子特征。

在另一项研究中,Khakh等人分离了来自同一品系小鼠纹状体和海马中不同脑回路的星形胶质细胞。他们使用钙成像、质谱、免疫组织化学、电子显微镜和RNA测序等方法来探测了细胞功能、形态和分子特征。

Khakh表示,大脑不同部位的星形胶质细胞不一样。例如,在海马体中,星形胶质细胞更靠近兴奋性神经突触,并且对神经递质谷氨酸的反应比对纹状体的反应更强。这挑战了‘胶水’的概念,因为它表明星形胶质细胞可能是脑区特异性的,甚至是神经回路特异性的。

Deneen的研究小组利用FACS分离了星形胶质细胞亚群,得到了分子数据,同时还进一步筛选了脑癌小鼠模型中这些细胞的存在。该团队确定了与肿瘤进展和癫痫发作相关的细胞亚型。Deneen指出,这些细胞亚群可以作为了解疾病中恶性星形胶质细胞特性的切入点。 

 

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星形胶质细胞具有独特的3D分支形状。

 

 

免疫抗体包被筛选法

最快、最简单的培养星形胶质细胞的方法发表于1980年,并且一直被沿用了下来。 Liddelow表示,从本质上讲,分离大脑、等待几周、在血清中培养细胞、清除顶部细胞,最后剩下的就是星形胶质细胞。这种方法快速便宜,无需特殊设备,可得到数亿个细胞。

这种方法以其发明者,教堂山北卡罗来纳大学医学院(University of North Carolina School of Medicine)的Ken McCarthy和加州大学洛杉矶分校(UCLA)的Jean de Vellis命名,名为‘MD星形胶质细胞培养法(MD astrocyte)’。但这种方法也受到了一些质疑。一个顾虑是:当星形胶质细胞在血清中生长时,它们开始变得与生理静息状态时完全不同。此外,Liddelow指出,该方法产生了相当数量的前体细胞,在研究特定问题时,这些前体细胞会对结果产生影响。
 
2011年,加州斯坦福大学(Stanford University)的Ben Barres实验室提出了免疫抗体包被筛选法。该过程首先通过在涂有靶向细胞表面抗原的抗体的平板上进行一系列孵育来去除不需要的细胞,然后使用识别整合素β-5(integrin β-5)的抗体分离星形胶质细胞。Liddelow指出,他们在培养皿中获得无血清的、成熟的星形胶质细胞,以及不到1%的其它细胞。Liddelow的实验室中就使用了这种技术。

尽管免疫抗体包被筛选法需要约6小时的手动操作时间,而MD方案只需要2-3小时,但抗体包被筛选得到的细胞可以立即使用,而MD方法提取的细胞需要3-4周才能投入使用。 Liddelow表示,免疫抗体包被筛选法并不总是最佳的选择。其产量比MD方法低约一个数量级。同时,该方法也更昂贵,因为它使用纯化的生长因子而不是血清来培养细胞。

Liddelow等人使用免疫抗体包被筛选法来鉴定两个星形胶质细胞亚群:A1和A2星形胶质细胞。A1星形胶质细胞失去了促进突触形成的能力,而A2星形胶质细胞神经营养因子表达增加。与这些特征一致,Liddelow的团队在阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏症和帕金森病以及肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症中发现了大量的A1星形胶质细胞,这提示着A1星形胶质细胞可能促进了神经退行性疾病中的神经细胞死亡。

 

实验室培养的星形胶质细胞

对于瑞典隆德大学(Lund University)的组长Henrik Ahlenius来说,星形胶质细胞为阿尔茨海默氏症、额颞叶痴呆和其它老化相关的疾病建模提供了一种新的治疗思路。但他的研究使用的是人类星形胶质细胞,其比小鼠星形胶质细胞更大,突触也更多,并且难以获得。

Ahlenius指出,如果你想研究慢性脑疾病的疾病进展或机制,那么要获得人类组织是一件非常麻烦的事。在极少数情况下,他的团队从活检组织或尸检组织中获取细胞,这些样本通常难以使​​用,因为它们来自终末期疾病。

2015年,意大利的研究人员展示了如何通过三种转录因子诱导小鼠成纤维细胞转化成星形胶质细胞——这一过程称为直接转化(direct conversion)——的技术。Ahlenius等人已经测试了人类胚胎干细胞中的这些转录因子,并发现其中两个——单独使用NFIB或使用SOX9 ——可在短短一周内产生纯度超过90%的星形胶质细胞。

这些细胞的行为就像纯化的人类星形胶质细胞一样:它们可以吸收和释放谷氨酸;对生长因子发生响应;支持突触形成;并与星形胶质细胞的基因表达非常类似。它们还可以用于模拟亚历山大病——一种罕见的神经系统疾病。 Ahlenius的团队在Nature's Protocol Exchange杂志上报道了这种方法。

 

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大鼠海马中被染色的星形胶质细胞呈现出“雪花”状外观。

 

基因编辑

为了理解星形胶质细胞在健康和疾病中的表现,研究人员需要可靠而特异性地编辑基因的工具,为此,Viviana Gradinaru在加州理工学院的实验室设计了基于腺相关病毒(adeno-associated viruses, AAVs)的载体。这些载体可以在静脉注射后将基因传递给小鼠大脑。这些载体允许研究人员在保持高表达的同时,上调或下调可编辑的细胞数目。

最终,科学家想研究星形胶质细胞如何与神经元相互作用。今年早些时候,Khakh小组开发了一种神经元—星形胶质细胞接近度分析法,用于确定星形胶质细胞实际连接到附近哪一个突触。Khakh表示,在不知道[一个细胞]的功能的情况下,你会在黑暗中环顾四周,试图确定它在那个环境中会做些什么。

该方法使用名为Förster共振能量转移(Förster resonance energy transfer, FRET)的技术来检测星形胶质细胞和表面表达荧光蛋白的神经元之间的物理接触。使用这种方法,以及他的实验室的定制AAV,Khakh的团队研究了星形胶质细胞如何与几种疾病的神经输入相关联。在中风的小鼠模型中,这些蛋白质标记的星形胶质细胞似乎扩大了它们的接触范围,而在模拟亨廷顿氏病的动物中,星形胶质细胞缩回它们的分支,与更少的突触相互作用。来自Gradinaru和Khakh的质粒构建体和病毒载体可通过全球非营利质粒库Addgene获得。

 

回路设计

加州大学旧金山分校(University of California, San Francisco)的神经科学家Kira Poskanzer研究了星形胶质细胞生物学的另一个方面:细胞如何响应外部信号。她指出,她们实验室的一个研究方向是找出哪些星形胶质细胞调控哪些神经递质的传递。

Poskanzer与布宜诺斯艾利斯大学(University of Buenos Aires)的分析化学家Roberto Etchenique合作设计“被关在笼中”的化合物,神经递质反过来会与限制它们与细胞中其它分子发生相互作用的这些化学基团结合。这些化合物是光敏感的,当用特定波长的光照射时,被其“锁住”的神经递质会被释放出来。

到目前为止,研究人员已经成功构建了光活化形式的神经递质谷氨酸GABA和5-羟色胺,并正在开发一种“笼中”去甲肾上腺素。Poskanzer 指出,他们正在努力建立一套工具,以便能够在神经回路上‘扮演上帝’——也就是说,光活化各种神经递质,并观察星形胶质细胞的反应。

同时,为了探究星形胶质细胞沉默时会发生什么反应,Khakh的团队开发出了一种方法,该方法使用分子泵将钙离子从细胞内部移动到外部,从而抑制小鼠脑部的星形胶质细胞的钙信号。他的团队正与霍华德休斯医学研究所珍利亚研究园区(Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus)的Loren Looger合作开发ATP传感器和星形胶质细胞释放的其它分子的传感器。

这些工具应该有助于研究人员进一步研究星形胶质细胞的生物学,以及整个互联大脑的生物学。 Khakh表示,这些技术极大地促进了我们“对星形胶质细胞如何促进大脑功能的认识”。

 


原文检索:
Esther Landhuis. (2018) Tapping into the brain’s star power. Nature, 563:141-143. 
张洁/编译

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