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shRNA表达克隆

临床代码破译者——DNA测序

Oct 16, 2018 No Comments

临床代码破译者——DNA测序1

罗伯茨个性化医学遗传学中心(Roberts Individualized Medical Genetics Center)的团队致力于将测序数据转化为有意义的临床信息。

 

 


DNA测序可以帮助医生了解各个病人的发病原因以及可能有效的治疗。

在一天的大部分时间里,宾夕法尼亚州费城儿童医院(Children’s Hospital of Philadelphia,CHOP)的基因组诊断部门的走廊都是空空荡荡、安安静静的,只有微弱的设备嗡嗡声和偶尔的谈话声会打破走廊的宁静。但是每天早上10点15分,走道上会迎来一群忙碌的临床医生、生物信息学家、遗传学家、咨询人员和行政人员,他们围在一起查看数据演示。在接下来的15分钟左右,这个多元化的团队将解决任何技术或后勤障碍,以便更好地实现其目标——提供准确的基因组数据,为严重,甚至可能致命的儿童疾病的诊断提供指导。

作为部门负责人,Nancy Spinner也对团队的蓬勃发展感到吃惊。她表示,现在发生的一切简直让人难以置信。自成立以来,她们团队的规模增加了一倍以上。该团队其实是2011年一项由Spinner和丈夫、临床遗传学家Ian Krantz领导的,名为PediSeq的研究的临床演变。 Spinner指出,Krantz对单基因测试的有效性非常失望:单基因测试需要把症状和已知的疾病基因有技术性地匹配起来,但事实上这基本上要靠运气。而当时Krantz则表示,我们需要改变遗传研究的方式。

目前临床测序服务现已在全球多个中心蓬勃发展。它们通常从试验研究中有机地进化,旨在探索基因组或外显子组(基因组中编码蛋白的那1%)的临床效用。

对于那些遗传基础被研究得较为充分的疾病,例如癌症和一些发育障碍,测序确实改变了诊疗方式。澳大利亚墨尔本基因组学计划(Melbourne Genomics initiative)执行主任Clara Gaff指出,他们发现,对于2岁以下儿童,有三分之一的患者因为基因测序而取得了更好的治疗效果。 

因此,基因测序在临床的采用率迅速飙升。今年,CHOP已经对300个外显子组进行了测序 ——这几乎是2015年全年测序数量的两倍。同样,儿科基因组学研究员Stephen Kingsmore等人在加速重病新生儿的诊断上的努力,成功推动了加州Rady儿童医院(Rady Children’s Hospital)的一项高效临床计划。Kingsmore 表示,每年约有200名孩子在他们的重症监护病房进行快速基因组测序。

但基于测序的诊断确定性不高,许多患者得到的结果报告里面并没有提供明确的诊断信息。而且,医疗测序中心不得不应对严峻的技术和医疗挑战,更不用说还要证明昂贵的测序计划能够提供具有成本效益的诊断解决方案了。

 

 

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Stephen Kingsmore(左)在加快新生儿遗传性疾病诊断方面做了开创性工作。

 

 

一个好的开始

大约有6-8%的儿童出生时患有遗传性发育障碍。这些疾病中的很多都起源于单一基因的突变,因此相对容易使用单基因测序确定疾病的“元凶”。有时,基于测序的发现使临床医生能够控制疾病发展。例如,CHOP的团队使用有针对性的外显子组分析将9岁患者的听力和视力问题与调节核黄素代谢的基因突变(一种可能导致严重的神经变性的突变)联系起来。 Spinner指出,核黄素补充剂可防止该患者视力和听力的进一步下降。Spinner补充,该患者的弟弟也接受了检测,结果显示他也携带了这种突变,因此“他可以更早地开始接受核黄素补充”。

这种成功是罕见的,通常能够坚定出致病突变的概率只有20-30%。但即使调查结果不能直接起作用,也能给家人心理上的安慰,并为医生提供信息。例如,英国牛津维康信托人类遗传中心(Wellcome Trust Centre for Human Genetics)的基因组医学主任Jenny Taylor指出,她的团队确定了遗传性肾脏疾病的遗传基础——这一发现有助于识别可能发生该疾病的家庭成员。

尽管早期的研究工作主要集中在研究较充分的发育疾病上,但临床测序中心正在开始扩大其范围。Kingsmore表示,他们对重症监护病房的病人的相关资料进行审核分析。主要能有一个孩子可以从基因组序列中受益,他们就会这样做下去。

目前在诊所中使用的大多数测试都是针对性的调查,使用“捕获”步骤来隔离外显子组。 Heidi Rehm和她在Partners 个性化医学公司分子医学实验室(Laboratory for Molecular Medicine at Partners Personalized Medicine)的同事经常分析外显子组,以诊断遗传疾病。他们对整个外显子组进行测序,但最初只分析靶向基因组以节省时间和金钱。只有当靶向基因组检测结果为阴性时,他们才会对其余的外显子组进行分析。

全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)捕获了外显子组分析中可能忽略的信息,但只有少数临床中心将WGS当做常规方法。维康信托人类遗传中心正是使用WGS的研究机构之一。Taylor指出,外显子组[测序]存在许多未解决的病例,他们没有对非编码和调控区域进行研究。然而,那些区域的遗传变异可能难以被解释清楚,并且WGS产生了相当庞大的数据,带来不少的调战。个体基因组可以包含数百万种突变,其中绝大多数不会与所讨论的疾病相关。

 

 

临床代码破译者——DNA测序3Heidi Rehm在Partners个性化医学公司分子医学实验室(Laboratory for Molecular Medicine at Partners Personalized Medicine)的团队对病人的外显子组进行测序。

 

 

即使对于外显子组来说,诊断也是一个艰苦的过程。任何给定的、可与健康个体对照的外显子组可能包含数以万计的核苷酸变化,并且每一个都需要与ClinVar(一个将基因数据与临床信息和可能的致病性评估结合起来的全球知识库)以及gnomAD(一个包含12万个外显子组序列,提示突变的常见程度的数据库)等数据库进行比较。一种罕见的疾病几乎肯定起源于一种罕见的突变,而且通过多样化数据库来消除种族或地理遗传差异造成的数据偏差非常重要。

许多实验室对“三人组”——患者和父母双方——进行测序,以消除健康家庭成员携带的良性差异。CHOP罗伯茨个体化医学遗传中心(Roberts Individualized Medical Genetics Center)的联合主任Livija Medne表示,将序列与人口数据库中的序列进行比较可以过滤掉95%以上的变化。Medne是Spinner团队的临床合作伙伴,他试图把突变数据转化为诊断信息。他指出,由于需要分析几百个突变是否致病突变,这个时候对家庭成员进行基因测序就非常有用了。

临床专业知识在基于DNA测序做出的诊断中具有无可替代的作用,临床医生小组通常会仔细审查所有数据,以确认任何可疑的致病突变是否为治疗靶点。这可能需要数月,但Kingsmore已经证明,将简化的诊断流程与智能生物信息学结合起来可以大大加快这一过程。他指出,在实践中,他们最快的常规基因组测试大约需要两天。建立如此高速的工作流程绝非易事,Rady目前正在向其他儿科医院提供服务。Kingsmore表示,他们计划与全世界的每一位儿科和新生儿重症监护病房共享这一平台。 

 

攻克肿瘤

分子遗传学也在改变癌症治疗,肿瘤学家试图根据病人的突变特征确定可能杀死肿瘤的个性化治疗方法。许多领先的癌症中心现在提供肿瘤测序服务,临床医生渴望利用这些服务。密歇根转化病理学中心(Michigan Center for Translational Pathology,该中心提供基于外显子组的MI-ONCOSEQ测序)主任Arul Chinnaiyan表示,他们已经对3000多名患者进行了DNA测序,而且他敢说,在超过90%的病例中,基因突变是肿瘤的驱动因素。

在某种程度上,识别肿瘤特有的突变比寻找导致遗传性疾病的突变更容易。肿瘤学家已经汇总了一个令人印象深刻的基因名单,这些基因已知在发生突变时会引发不受控制的细胞生长和侵袭,而一些研究机构——包括CHOP——基于该名单,取得了巨大的成功。CHOP癌症基因组诊断主任Marilyn Li指出,超过90%的阳性检测具有诊断或预后意义。

癌症突变通常比发育障碍中常见的单碱基突变更复杂。当基因被复制、缺失或剪接到不相关的基因上时,通常会导致染色体损伤,随后诱发癌症。虽然这些结构变化可通过靶向基因测试或基于外显子组的测试而被检测出来,但WGS则能更可靠地捕获它们。德克萨斯州休斯顿贝勒医学院(Baylor College of Medicine)的遗传学家Sharon Plon表示,WGS在鉴定包括染色体易位和倒位的结构重排上功能非常强大。

在遗传性疾病中,突变存在于整个身体中。而肿瘤不同,肿瘤可能是高度异质的,癌细胞和健康细胞混杂在一起,并且在肿瘤内部也存在大量的遗传变异。这意味着必须为给定区域获得更多的测序读数,以确认突变是真实致病的。但这会增加测序的成本。越来越多的实验室也在进行外显子组和RNA分析,以检测有缺陷或以不适当水平产生的基因产物。Plon指出,这是一种成本相对低的方式,它试图更直接地分析突变对蛋白表达的影响。

此类分析可以多种方式影响患者护理。例如,可能存在针对所述突变的药物。Chinnaiyan指出,他们的病例中有30-40%的测序结果最终可能会影响临床结果。在许多情况下,对于给定突变可用的唯一治疗方法是实验性治疗,这意味着必须进行“临床试验,患者必须能够进入临床试验”。突变分析还可以纠正诊断,并改善预后。这是因为一些基于病理学的诊断并不准确。Taylor表示,鉴于他们一位患者的预后有所改善,因此他选择了放疗而不是化疗。 

 

 

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Arul Chinnaiyan(中)是密歇根转化病理学中心(Michigan Center for Translational Pathology)的负责人。

 

团队正在扩大

临床测序的主力是HiSeq 2500机器。该仪器可以在27小时内产生全基因组序列——虽然这个速度相当惊人,但不一定足以满足许多临床测序中心的需求。

2017年,Illumina通过NovaSeq增加了容量,NovaSeq可以更快地生成更多数据。据Kingsmore介绍,它可以在15.5小时内解码多达6个基因组。他的团队最近开始使用该仪器。但是,价格接近100万美元,还不包括试剂和日常维护。因此NovaSeq是一笔沉重的投资。即使是较便宜的仪器也会使医院预算紧张(参见文末“成本控制”)。

人力因素仍然是基于测序提供诊断的主要瓶颈,但Li的团队正在使用基于机器学习的方法,进行智能分析——让机器学习如何在高度突变的癌症中区分信号与噪声基因组。她表示,这使她们可以过滤掉70%的突变,减少人力成本,大幅提高效率。通过将NovaSeq连接到涡轮增压人工智能平台,Kingsmore和他的团队设法在19.5个小时内完成了从样本到诊断结果的整个流程。

尽管如此,许多诊断尝试仍然令人失望。令人印象深刻的是,基因测序只有50%的“命中率”,它仍然意味着将有一半的患者毫无收获。对于多个类别的遗传疾病来说,基因测序无法得到诊断信息的概率是70-80%。Gaff指出,这种不确定性对临床遗传学家来说并不新鲜——自20世纪90年代早期乳腺癌基因检测以来,他们一直在努力解决不确定性的问题。她指出,调整临床医生的期望是至关重要的,医生通常对基因组测试太过热情,但并不是每次都会产生理想结果;另一方面,持怀疑论也是不合适的。

随着数据越来越多,诊断结果将会越来越明确。今年早些时候发表的一项研究表明,一年后的随访分析可以诊断11%以前尚未解决的临床外显子组病例,Taylor的团队正在进行数据再分析。她表示,她们从不认为病例已经结案。随着急切的患者排队等待分析,临床基因组学家热衷于尽可能地帮助他们。Taylor认为,如果价格合适,每个癌症患者都应该对他们的肿瘤进行测序。

临床医生现在将目光投向其它疾病,如糖尿病或心血管疾病,这些疾病的起源十分复杂。虽然目前基因测序还无法诊断这些疾病,但研究工作正在探索基因组学在更广泛的病人群体中的益处。多伦多儿童医院遗传医学中心(Centre for Genetic Medicine at Toronto)联合主任Christian Marshall指出,英国生物银行(UK Biobank)正在收集大量来自50万名志愿者的生物医学数据——在许多情况下包括外显子组,以预测长期健康和疾病。一旦你开始对成千上万的人进行测序,并配对表型数据,那么就有可能在日常的医疗系统中使用基因组学。

除了技术能力,Medne认为整个社会需要一段时间才能进入这个阶段。它还需要人们更好地了解发育或传播遗传性疾病的风险意味着什么,并为潜在的歧视制定更好的法律保护措施。 Medne认为,我们需要把基因组学作为医疗保健的一部分。而现在,基因组学只是疾病的一部分。

 

 

更多阅读:成本控制

当就职于英国牛津维康信托人类遗传学中心的Jenny Taylor听到单个基因组的测序成本达到1,000美元时,简直惊呆了。她表示,她们在牛津用小型设备测序的价格远低于这个。虽然使用大规模设施的测序价格确实可以低于1,000美元,但大多数中心的费用是这个数字的几倍。实际上,基于外显子组或基因组的诊断价格分别可超过5,000美元和24,000美元。

建立一个研究中心是一项巨大的投资,特别是对于顶级的仪器来说尤为如此。加拿大多伦多儿童医院遗传医学中心(Centre for Genetic Medicine at the Hospital for Sick Children)联合主任Christian Marshall指出,机器价格高达数百万美元,医院很难为它们买单。Stephen Stephenmore表示,尽管加州Rady儿童医院成功地大幅缩短了测序时间,但设备和计算基础设施的支出为1,000万美元。拥有大量诊断流量的实验室可以证明这些尖端机器是合理的——但只有当机器使用率很高的情况下才能证明这一点。麻省波士顿Partners个性化医学公司(Partners Personalized Medicine)的临床遗传学家Heidi Rehm表示,你必须拥有支持这些高通量仪器的样本量。该公司现将其基因组测序外包给附近的博德研究所(Broad Institute)。

另外,专业知识也不便宜,数据分析也有很高的成本。宾夕法尼亚州费城儿童医院(Children’s Hospital of Philadelphia)的基因组诊断主管Nancy Spinner表示,一些外显子组包含1000个可疑的突变,必须仔细筛选出来,并进行诊断。她指出,总而言之,实际分析时间可能在3到16个小时之间。数据分析需要一支训练有素(而且收入丰厚)的专家团队。事实上,一个环节削减成本会增加另一个环节的成本。例如,对“三人组”进行测序,增加了2倍的测序成本,但节省了大量的分析时间。

这些高昂,且不可预测的成本对私营部门医疗保健支付者和国家卫生系统构成了挑战,因为他们努力评估基因组筛查的成本效益。澳大利亚墨尔本基因组学计划(Melbourne Genomics initiative)执行主任Clara Gaff表示,关键是要发挥测序的优势。例如,她和她的同事已经证明,使用外显子组诊断可以将诊断能力提高三倍,其价格是幼儿遗传性发育障碍的传统诊断技术的三分之一。Gaff指出,在早期诊断中使用基因测序,并取消其它测试,其实是能降低成本的。

 

 

原文检索:
Michael Eisenstein. (2018) The clinical code-breakers. Nature, 562:291-293. 
张洁/编译

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