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解密RNA结合蛋白

Sep 11, 2018 No Comments

解密RNA结合蛋白2

在真核细胞中,RNA可以赤裸,也可以“穿着”蛋白质。与RNA结合的蛋白质被称为RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP),它们拥有强大的基因调节能力。

 

 

RBP的研究方法非常多,研究人员正在改进方法,以解决更多生物学问题。

小衣服,大作用。真核细胞中的RNA可以是赤裸的,也可以穿上衣服——蛋白质。细胞中的一些RNA(包括非编码RNA)会与蛋白质结合,隐藏某些RNA区域,并暴露其它RNA区域。RNA结合蛋白(RBP)是功能强大而广泛的调节因子,它们在细胞发育、分化、代谢、健康和疾病中发挥重要作用,最近受到了研究人员的密切关注。部分研究聚焦于RBP分析,例如了解哪些RNA与哪些蛋白质会发生结合。

加州理工学院(California Institute of Technology)研究员Mitchell Guttman指出,蛋白质负责实现功能,而RNA负责协调这些蛋白质的活性,将蛋白质组合成一个连贯的单元,以实现独特的功能。脱离了RNA,这些蛋白质便无法发挥作用。在Guttman看来,RNA与蛋白质结合后,RNA便成为了一系列RNA相关的复杂功能(例如翻译、剪接、定位)的“中心”。从另一个角度来看,蛋白质也是“中心”,因为它们介导细胞事件,如酶促反应和定位。RBP和RBP复合物调节转录和翻译、基因表达和RNA的加工。

哥廷根马克斯普朗克生物物理化学研究所(Max Planck Institute for Biophysical Chemistry)生物分析质谱小组的负责人Henning Urlaub表示,蛋白质可以弯曲、折叠或挤压RNA,导致RNA发挥催化作用,就像真核生物剪接体——一种3D RNA反应中心——一样。蛋白结构和结构域有成千上万种,而RNA结构也有数千种,因此RNA与蛋白的结合存在无数可能。

Guttman表示,一些RBP相关方法强调蛋白质提取和纯化,而其它方法则强调RNA捕获,然后利用质谱分析那些与RNA结合的蛋白质。在更多以蛋白质为中心的方法中,研究人员使用紫外线交联揭示RNA和相关蛋白质的位置,然后用抗体进行免疫共沉淀。待“pulldown”材料变性后,便可对RNA进行测序,以鉴定RNA的蛋白质结合区域。以RNA为中心的方法也可能使用紫外交联,并且利用各种不同的诱饵,从细胞裂解物中提取RNA。

Urlaub指出,一些实验室正在寻找与RNA相互作用的蛋白质区域。他们在交联后使用质谱来鉴定该蛋白质中的交联区域和氨基酸(低至蛋白中的几个氨基酸)。在他们的实验设计中,他观察到一些研究人员可能对蛋白质-RNA相互作用产生偏见:他们有时认为缺乏已知RNA结合基序的蛋白质不能与RNA结合,但事实并非如此。此外,由于与RNA强烈结合的一些蛋白质区域无法很好地交联,因此利用交联方法难以检测到。

 

 

Stefanie Gersberger2

Stefanie Gersberger表示,关于RBP的调控机制和生理功能,还有无数谜题等着我们去解开。

 

 

中国科学院广州生物医药与健康研究院(Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health)的研究员Miguel Esteban表示,丰富的RBP分析方法要求科学家做出深思熟虑的选择。使用多步骤协议研究RBP可能会遇到很多方法相关的故障。浓缩方法其实有一定的倾向性。基于RNA沉降的方法,可能会遗漏一部分RBP蛋白。

 

 


Miguel Esteban2

Miguel Esteban指出,一些RNA与蛋白质之间的相互作用非常精巧。

 

哥伦比亚大学(Columbia University)的医学博士生Stefanie Gerstberger表示,每种方法都有局限,都有其适用的特定的试验场景。2016年,Gerstberger在洛克菲勒大学(Rockefeller University)Tom Tuschl的实验室完成了博士研究的一部分,统计了人类RBP。她指出,采用非靶向方法,你会发现一张包含各种非特定RBP的图谱。例如,该图谱可用于评估细胞的一般状态,以及转录组状态。

Gerstberger表示,现在有很多RBP资源,包含来自各种细胞类型和不同数据深度的信息。用户能看到实验结果之间的差异,因此,最简单、最好的实验方法是从头开始控制可变因素。

虽然RBP方法可以分为以蛋白质为中心或以RNA为中心,但Guttman指出,研究RBP的生物学需要将两类方法结合起来。欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory)负责开发和使用RBP分析方法的研究者Matthias Hentze认为,这种方法上的差异,根源是研究人员学术背景的差异。一些实验室更关注核酸,而另一些实验室更关注蛋白质或采取更广泛的蛋白质组学方法。生物学并不关心研究者的背景,我们应该无偏见地看待这两种方法。

 

 

Matthias Hentze2

Matthias Hentze表示,很多RBP不具有可识别的RNA结合域。很显然还有很多未被发现的RBP。

 

 

RBP普查

大约5-10%的人类蛋白质可以与RNA结合。到目前为止,研究人员尚未对所有RNA结合蛋白进行普查,已知的RBP数量仍然是估计数。科学家基于现有研究,认为哺乳动物细胞存在1000到2000个RBP。

 

 

一些方法集中于表征RBP中的蛋白质

一些方法集中于表征RBP中的蛋白质。

 

基于来自脊椎动物基因组浏览器Ensembl的mRNA亚型数据和来自RNA-蛋白质交联实验的质谱数据,Gerstberger绘制了人类细胞中的RBP图谱。Gerstberger估计,在人类细胞中存在1542个RBP。她认为可能还有更多的RBP,例如以特定或非特异性方式结合RNA的蛋白质。它们可能是一类没有被表征的蛋白家庭,也可能是某个已知蛋白质家族的单个蛋白。Hentze表示,对于标准培养条件下的普通哺乳动物细胞,具有生物学功能的RNA结合蛋白质的真实数量可能达到2000个。他建议,在实验室观察物种时,需要注意物种之间的特定差异,例如生物体可能进化得到的特定RBP。

尽管不同研究人员对RBP总量的估计都不相同,但Gerstberger认为,更重要的是了解已知RBP的功能和调控。发现新的、可能与RNA结合的蛋白意义不大。更重要的发现在于RBP的调节和生理功能。

 

 

RNA与RBP之间的作用是双向的

RNA与RBP之间的作用是双向的:RBP可以调节RNA,而反过来RNA也可以调节RBP。

 


Esteban指出,通过大型研究确定RBP总数具有重要价值。即使不知总数,各大实验室的研究也会让RBP的相关数据丰富起来。鉴定RNA与蛋白质结合后发生的生理功能至关重要。例如,代谢酶经常与RNA相互作用,并不一定就意味着RBP可调节新陈代谢;相反,RBP可以扮演其它未知的角色。

Guttman表示,无论是协同努力,还是通过许多实验室的集体努力,如果要汇编完整的RBP目录,那么根本不可能只以一种实验方法为基础。随着实验室更多地了解microRNA、lncRNA、环状RNA和其它知之甚少的RNA类,RBP目录可以成为评估RBP功能和机制的索引。这样研究RBP就不再像是西部开荒,而是按图索骥,寻找一个个金矿。

 

 

交联

当学生通过紫外线灯手段将RNA交联到蛋白质上时,Esteban提醒他们,要制备一份非交联样本,并设定其它实验检查点。虽然这会让实验的准备工作增加一两天,但可以解决后续的麻烦。他还建议,一定要分析丰度更高的蛋白质是否会覆盖其它蛋白,导致后者更难被检测出来。例如,细胞中的一些RNA种类,如ncRNA对细胞功能非常重要,但它们只占总RNA量的很小一部分。

日本理化学研究所(RIkagaku KENkyusho/Institute of Physical and Chemical Research, RIKEN)的研究员Piero Carninci表示,不同的基因表达差异可达到四到五个数量级,因此在实验室使用全细胞时,很难获得低水平转录的RNA。Carninci还指出,研究人员可以尝试更有针对性的方法来鉴定与特定区域结合的RNA。例如,他的团队一直致力于捕获染色质上附着的lncRNA。他们通过测序与特定基因组位置相关的RNA-DNA对来捕获这些复合物,然后统计分析相互作用的频率,并探索重要性。Carninci提醒,在这种情况下,测序引入了一种可衡量的方法来计算和评估结合频率。

正如Guttman所解释的那样,当使用紫外线而不是甲醛时,交联数据的噪音较小。紫外线是一种零距离交联剂,意味着只有当蛋白质和RNA接触时才会发生交联。也就是说,即使蛋白质和RNA之间只有非常小的距离,紫外线也无法引起它们的交联。因此,紫外线交联是交联实验的“金标准”,可判断体内是否存在相互作用?然而,交联的高度特异性也可能是一个缺点,例如RNA处于不正确的构象时,也无法发生交联。Guttman指出,另一个重要方面是交联往往只涵盖RNA-蛋白质相互作用的1-5%。实验室往往只能检出很小一部分的RNA-蛋白相互作用。为了检出这些低丰度的相互作用,研究人员需要对大量细胞进行实验。

 

 

新技术

正如Gerstberger指出的那样,RBP研究可以追溯到20世纪50年代。随着时间的推移,高通量方法纷纷问世,这些方法包括RBP免疫沉淀、RNA的cDNA阵列杂交,以及基于SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指数富集的配体系统进化技术)选择RNA配体的方法。RNA测序和质谱可以在更高的通量和转录组水平上对RBP进行分析。一些技术结合了测序和免疫沉淀,也就是所谓的CLIP-seq(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing,紫外交联免疫共沉淀测序)方法。

事实证明,通过多腺苷酸化尾巴沉降RNA是一项重大的方法学进展。有两种方法可以做到这一点:一种由Max Delbrück分子医学中心(Max Delbrück Center for Molecular Medicine)的Landthaler实验室开发,另一种由Hentze实验室中开发。

这两种方法是并行开发的。Hentze指出,两个实验室均知道彼此的努力、方法和结果,这两个团队独立研究,但经协调后同时发表。其实两种方法几乎相同,只是缓冲液略有不同。在这两种方法中,在活细胞中使用紫外光诱导蛋白质与RNA的交联,然后通过poly(A)尾部来pulldown RNA,并且使用oligo(dT)磁珠捕获多腺苷酸化的RNA。下一步是质谱鉴定和定量蛋白质。

Hentze表示,使用表面包被了oligo(dT)的磁珠来捕获RNA有助于实验室发现RBP,并了解与RNA结合的蛋白质类型。实验室已经调整了这些方法,例如,加入了生物素化的核苷酸类似物,然后进行了pulldown步骤。

正如MaxDelbrück分子医学中心的Markus Landthaler等人指出的那样,30多年前,各大实验室试图用oligo(dT)琼脂糖层析分离poly(A)RNA结合蛋白质组。从那时起,研发人员已经采用更全面的方法来识别基于紫外线的交联和测序的RBP,以确定RNA结合位点。例如,这些方法现在被用于比较不同条件下的健康和患病细胞。

Landthaler等人使用该方法研究了涉及感染和修复DNA损伤的途径。在乳腺癌细胞中,他们鉴定了超过260个RBP。在电离辐射响应情况下,这些RBP与mRNA发生了更多的相互作用。该团队使用基于4-硫尿苷(4sU)的mRNA捕获方法和基于同位素的标记技术SILAC来标记细胞,并帮助定量样品中的蛋白质差异。4sU整合到RNA的能力可能因细胞类型而异,因此需要在实验开展前测试核苷浓度和孵育时间。

Landthaler与其他人共同开发的一种方法是PAR-CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced cross-linking and immunoprecipitation,基于光活化核糖核苷的交联和免疫沉淀技术)。活细胞吸收光反应性硫代核苷(4sU),4sU增强了RNA和蛋白质之间的交联。该方法通过对胸苷-胞苷转换进行分析,从而揭示RBP结合位点。研究人员指出,该方法能够在转录组范围内识别靶向RBP的RNA结合位点。

为了捕获具有多腺苷酸化尾部的RNA以外的RNA类型,Esteban开发了RICK技术,即通过点击化学捕获新转录的RNA组。该方法包括使用5-乙基尿苷标记RNA,然后使用点击化学进行生物素化步骤。接下来是使用磁珠捕获RNA,之后对RNA进行测序,并通过质谱分析蛋白质。Esteban团队正在应用RICK捕获干细胞中新生成的RNA,以了解不同条件下RBP的类型和模式,以及RBP在具有某些突变的细胞中发生的变化。Esteban表示,捕获新转录的RNA提供了关于RBP功能方面的提示。

 

 

对抗噪音

Hentze指出,当比较不同条件下的细胞时,信噪比变得尤为重要。背景噪音可能会影响结果和分析。较小但重要的变化可能会被忽视。他认为对现有技术进行降噪非常重要,因为这样可以更好地分析差异。

 

 

采用乳腺癌细胞来研究DNA损伤响应的方法

采用乳腺癌细胞来研究DNA损伤响应的方法。

 

Hentze实验室和其他实验室正在探索用锁核酸(LNA)取代oligo(dT)来pulldown多腺苷酸化RNA。例如,oligo不再是20个deoxy(T),而是一串deoxy(dT)和LNA的混合物。相比于deoxy(T),LNA的熔化温度更高,这使得实验者可以更加严格地进行纯化的洗涤步骤。洗涤越严格,就可以洗掉更多的非特异性结合成分。在Hentze的方法和来自Landthaler实验室的方法中,“核糖体RNA的重要信号”非常杂乱,而如果使用LNA,那么噪音则会大幅降低。多腺苷酸化的RNA停留在磁珠上,并且rRNA和混入的DNA也可以以更严格的方式被洗脱。

Guttman指出,实验室长期以来一直在探索更严格地纯化RNA结合蛋白的方法,并尽可能多地消除非特异性结合。他指出了2006年发表的一种方法,该方法应用肽核酸实现严格洗涤。Guttman看到LNA的优势:LNA很短,并且具有高熔化温度,这适合更严格的洗涤。但LNA也不乏缺点:它们不能在实验室中合成,只能购买。而且LNA的价格十分昂贵。

RAP-MS是Guttman实验室开发的一种方法,该方法应用生物素化探针和RNA反义纯化策略。该团队使用单链、生物素化的90-mer oligo,这种oligo具有高熔融温度,并且可以在实验室中合成。Guttman指出,oligo混合物很稳定。它可以在离液剂(chaotropic agent),例如6M尿素中变性和洗涤,并保留与RNA共价交联的物质。他和他的团队研究了长度约为17000个核苷酸的lncRNA。考虑到RNA的脆弱性,仅使用一种探针(例如LNA)是有风险的。当探针破裂时,与RNA结合的蛋白大部分都会丢失。在他的实验室中,研究小组将lncRNA与许多90-mer探针拼接在一起,这样即使RNA断裂也能捕获RBP。

为了解决纯化问题,Hentze实验室开发了2C方法,其基本原理是蛋白质不会与二氧化硅柱中的树脂结合,而RNA会与其结合。Guttman认为这是一个非常有趣的现象,它可以让RBP纯化变得更简单。2C方法涉及使用二氧化硅柱来分离交联的RBP。

通常,实验室需要通过免疫沉淀、洗涤、标记交联RNA、洗脱和放射自显影来验证RBP。 2C方法避免了免疫沉淀和放射性标记。如果蛋白质与RNA交联,那么RNA就会粘附在树脂上,从而使与其结合的蛋白质也粘附在树脂上。Guttman指出,我们可以严格洗涤粘附在树脂上的其它物质,从而实现更好的RBP纯化。他对此感到非常兴奋,因为这是一种纯化RNA结合蛋白的新方法。

 

 

形态很重要

Esteban表示,蛋白质是三维分子,只有在某些条件下才能暴露出“良好”的RNA结合结构域。这些结构域很难用生物信息学来识别。RNA形成2D结构,因为热力学性质和其它特性,RNA的2D结构将决定哪些蛋白质结合在哪里。RNA也根据其结合的蛋白质改变构象。结构和功能是分不开的。 细菌核糖开关是一种能够感知细胞营养素的RNA。在对营养素的反应中,核糖开关改变其结构,从而实现基因表达等功能。Esteban表示,哺乳动物细胞中可能也有能实现这种功能的RNA。

Guttman指出,研究RNA结构仍然是一项挑战,但有一些方法有助于确定RBP的特征。北卡罗来纳大学(University of North Carolina)Weeks实验室开发的SHAPE(selective 2-hydroxylacylation analyzed by primer extension)技术(也即可在活细胞中通过引物延伸分析、选择性地进行 2' 羟基酰化作用),通过测序检测的方式用小分子标记可访问的、动态的RNA区域。探测RNA结构的另一种方法是使用加州大学(University of California)旧金山分校Weissman实验室和麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology, MIT)的Silvi Rouskin等人开发的DMS-MaPseq方法。为了在RBP中标记特定的RNA基序,斯坦福大学医学院(Stanford University School of Medicine)的Paul Khavar等人开发了RNA-蛋白质相互作用检测法(RNA–protein interaction detection,  RaPID)。该方法采用生物素化,从而实现更严格的洗涤,提高了RBP的纯度。

Hentze表示,鉴于许多RBP都没有可识别的RNA结合结构域,所以还有很多未被发现的RBP。Hentze的团队开发了RBDmap来寻找RNA结合域。他指出,该方法可以发现尚未鉴定的富含RNA的结合区域,例如高度非结构化的蛋白质区域和低复杂性区域。在RBDmap中,另一轮的olido(dT)捕获了交联的RNA和蛋白质,以及与该蛋白质邻近的肽,从而鉴别出RNA结合结构域。

Urlaub指出,从细胞层面来说,现有方法还不够定量化,而且特异性不够。RNA和蛋白质之间相互作用的变化需要根据细胞周期和各种细胞的状态来定性和定量。例如,实验室想要知道蛋白质的多少拷贝会与一个RNA分子结合,以及不同蛋白质结构域对不同RNA的作用是否不同。他还表示,研究具有与RNA结合的重复氨基酸序列的低复杂性蛋白质区域仍然难度很大,因为它们几乎不可能质谱来研究。

Esteban指出,也许有些RNA以几种不同的方式与蛋白质结合。他认为我们需要改变思路。RNA和蛋白质结合间的相互作用可能比其它蛋白质“更微妙,更细腻”,并且这些相互作用增加了调控的复杂性。此外,RNA和蛋白质都可以通过各种方式进行修饰,这是影响调节的另一个方面。

Hentze则表示,RNA可以进化出与特定蛋白质表面结合的能力,这意味着“原则上任何蛋白质表面都可能是RNA的结合表面。人们开始从新的角度出发认识RNA与蛋白质的结合。RNA结合蛋白可以调节与之结合的RNA,反过来,RNA也可以调节RBP。他的团队发现参与自噬(自噬是细胞清理碎片的过程)的蛋白质受到一种名为vaultRNA-19的ncRNA的调节。

Hentze实验室在研究一种名为enigmRBP的RBP。他指出,EnigmRBP与RNA的结合过程非常神秘,这意味着我们很难确定它们的结合位置。研究小组发现,小的ncRNA通过与enigmRBP的结合来调节其功能,从而调控自噬。RNA蛋白相互作用具有与蛋白质-蛋白质相互作用相同的功能,即调节蛋白质功能。在Hentze的研究中,RNA充当核心调节剂以调节自噬通量。这些研究结果表明,RBP赋予了细胞基因组“以更直接的方式调节生物学和生物过程”的能力。

关于RBP多功能性的观察为RNA世界假说(RNA World Hypothesis)增加了可信度。该假说认为,地球上的生命始于RNA,然后是蛋白质的进化,最后才是DNA的进化。Hentze实验室的一系列发现,包括这种最新的核糖调节剂以及RNA在RBP中的调节作用,都符合RNA世界假说。Hentze认为,这可能是进化早期的生物调节方式。

 

 

原文检索:
Vivien Marx. (2018) Profiling the dress codes of RNA-binding proteins. Nature Methods, 15:665-668. 
张洁/编译

 

 

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