科学家教你DIY显微镜

定制显微镜，例如图中所示的IsoView层照显微镜，在性能上能超越商业显微镜，帮助科学家更好地进行研究。

当市面上的显微镜不符合自己的科研需求时，一些科学家会选择自制显微镜。

在费城宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）攻读生物工程博士学位时，Wesley Legant遇到了一个巨大的障碍：他有想法，但是实施这些想法的设备还不存在。

Legant对细胞力学和运动有着浓厚的兴趣，因此他开始开发测量细胞对其环境的作用力的工具，将荧光珠嵌入哺乳动物增殖细胞周围的材料中。当细胞移动时，材料会变形，荧光珠的位置也会发生偏移。通过测量荧光珠的移动量，Legant便可以计算出细胞所施加的力。不过，他很难获得准确的数据。Legant表示，这些工具是没问题的，有问题的是市售显微镜。

细胞在自己的力量下移动缓慢——最快的速度不过每分钟几微米——所以显微镜需要长时间地观察细胞移动。为了跟踪三维珠子，Legant不得不以高空间分辨率对整个空间进行成像。鉴于当时是二十世纪末二十一世纪初，所以可用的商业显微镜——点扫描和旋转盘共聚焦显微镜 ——无法达到这个成像要求。

Legant指出，实际上，这两种技术的分辨率是足以完成让他们想要做的跟踪的，但是这些技术光敏性太强，太慢了。

试想象一个透明的立方体。共聚焦显微镜可以让科学家逐一捕捉立方体中的每一个点，然后逐渐构建一个3D图像。为此，他们往样品上垂直投射一束光线，采集立方体每个点处穿透的光线。但每次照射都会产生活性氧，从而损害样品——Legant称之为“光毒性”效应。并且，荧光团的荧光强度会随着光照时间和次数的增加而减弱，也就是所谓的“光漂白”。

在Legant的实验中，每个3D图像的获取大约需要一分钟。然后，他必须再等5分钟才能拍下下一张照片，从而让细胞有时间从光毒性中恢复过来，防止其在集齐所需数据之前死亡。虽然他确实能测量细胞施加的力，但精度没有达到预期。

为了解决这些问题，在其博士后研究阶段，Legant转移了焦点。他与霍华德·休斯医学研究所珍利亚研究园区（Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus）的物理学家、显微镜专家Eric Betzig合作，即加入了小而不断发展的显微镜DIY团体。

实时成像

搭建显微镜是一项复杂且耗时的挑战，这需要一支技能合适的团队来处理所涉及的光学、机械和计算机问题。但回报可能非常可观。一个新的显微镜不仅仅可以推动生物学发展，还能推动显微镜科学自身的发展。

在珍利亚研究园区，研究人员突破了神经科学和发育生物学的界限。这两个领域都高度依赖显微镜和成像技术，珍利亚研究园区拥有大量的现成商业显微镜。但是，当需要的工具不存在的时候，科学家们不会坐等商业公司来开发——而是自己搭建。

珍利亚研究园区的一位物理学家Philipp Keller指出，他们想开展新型的试验，虽然商业显微镜达不到要求，但没有关系，这会激励他们自己去DIY显微镜。Keller的研究方向是探索斑马鱼和果蝇的神经系统发育。

在21世纪中期，Keller在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory）工作时遇到了一个与Legant的问题类似的问题：他想跟踪发育中的斑马鱼胚胎中的所有细胞，以了解它们如何移动，并聚结形成不同的组织和器官。但是，大多数现有的显微镜不能在不杀死细胞的情况下，长时间对这样大的样本（大约700毫米直径的细胞球体）进行成像。

研究者们可以自行调整显微镜的设计，改变参数，正如OpenSPIM.org网站上的那些显微镜一样。

鉴于此，Keller开始研究光片照明显微镜（light-sheet microscopy）——一种刚刚投入使用的技术。光片显微镜不是直接照亮整个样品，而是将弱光聚焦，以低强度的“光片”直接投射到用户想要成像的物体的焦平面上。高质量的相机可以在一次曝光中捕捉整个焦平面，并通过垂直移动焦平面，从而重建整个3D物体。

Keller表示，光片显微镜是一种非常快速的成像技术，而且非常温和。焦点以外的结构不会暴露于光线之下，因此也不会受到光损伤。鉴于当时没有现成的显微镜适合Keller的研究，因此在2005年，他决定自己造一个。他的设计被称为数码扫描激光光谱荧光显微镜（Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscope, DSLM），它可以在90秒内捕获正在发育的斑马鱼胚胎中的每个细胞。

并不是所有的显微镜DIY科学家都是为解决特定科研问题才自己造显微镜的。对于德国马克斯普朗克生物物理化学研究所（Max Planck Institute for Biophysical Chemistry）的物理学家Stefan Hell而言，在显微镜中提出新的概念本身就是一个目标。对此，Hell指出，这是一个科学项目。他DIY显微镜是为了提出一个推动显微技术发展的想法。

最终，Hell成功了。2014年，Hell与斯坦福大学（Stanford University）的William Moerner以及Betzig共同获得了诺贝尔化学奖，获奖理由是发明超分辨荧光显微镜技术，使研究人员能够在纳米尺度下对生物结构进行成像。

尽管Hell已经搭建和商业化了几种显微镜的设计，但是很少有生物学家会去效仿，这很大程度上是因为商业制造商很快就会跟进并推出新的设计。他获得了诺奖的设计——受激发射减损（stimulated emission depletion, STED）在1999年时耗费了他20万美元。现在，STED显微镜可能只有半个鞋盒那么大，并且可以被连接到任何现有的共聚焦荧光显微镜上。Hell表示，还有几家公司在制造光片显微镜。

然而，Keller指出，光片显微镜领域还比较年轻，而且商业化系统明显落后于最顶尖的设计至少七八年。鉴于此，他们没办法，只能自己搭建。

这个过程既有利也有弊。定制系统在速度和分辨率方面可能领先数年，并且可以定制为专注于特定生物问题或系统。但这是以灵活性为代价的。在一些DIY系统中，要改变放大倍数可能都很难。定制系统需要花费宝贵的时间和精力进行设置和维护。

美国马里兰州贝塞斯达国家心脏、肺和血液研究所（US National Heart, Lung, and Blood Institute）的细胞生物学家Clare Waterman指出，对那些愿意接受挑战的人来说，回报是值得的。在20世纪90年代早期，Waterman使用了一种新的相机技术，开发了一种名为荧光散斑显微镜（fluorescent speckle microscopy）的技术。该技术可以研究细胞骨架和其它大型多蛋白复合物。她表示，好处是，有了这种技术，你能得到其他人得不到的答案。缺点是你必须自己解决所有的问题。但这样其实很有趣！

DIY指南

无论是推进显微镜还是回答特定的生物问题，构建新显微镜的过程大致相同。Keller在这方面非常有经验，他指出，过去每一年他们都在研发新的显微镜，他已经把工艺细化到了最基本的要素上了（见“十步DIY显微镜”）。一个好的显微镜团队需要一个物理学家或生物医学工程师以及四名专家：一位光学工程师来规划光学布局；一位机械工程师来研究这些零件如何组合在一起；一位软件开发人员来编程，以及一位计算机科学家将原始数据转换成可用的图像。

十步DIY显微镜
制作显微镜非常复杂。但霍华德·休斯医学研究所珍利亚研究园区（Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Research Campus）的物理学家Philipp Keller把这个过程拆分成十个可行的步骤：
•就仪器的设计进行头脑风暴。
•规划和测试光学设计。
•使用计算机辅助设计软件来设计主体和定制部件。
•订购部件，并制造定制的机械和光学部件。
•借用组件来测试其性能和集成的简易性。
•组装原型。
•编码显微镜控制软件。
•根据性能细化自定义组件。
•进行原理验证实验。
•开发和改进图像处理软件。

第一步是光学设计。这一步需要使用专门的软件——Keller和Legant使用的是OpticStudio软件（可从华盛顿州柯克兰市的Zemax公司获得）。这类软件可以仿真，根据需要的分辨率和特性来安排激光器、透镜、反射镜和其它光学部件的正确分布。

然后，机械工程师根据设计结果，思考如何把所有这些部分真实地融合在现实世界中，例如用螺栓把零件固定在光学平台上。一位在珍利亚研究园区和Keller合作的机械工程师Brian Coop表示，在此之前，你看到的，只是一排漂浮在空中的镜头。这需要他来把这些设计落实。

Coop指出，现阶段最大的挑战是其物理限制。当显微镜必须专注于几微米乃至几纳米的尺寸时，几乎不允许误差的存在。镜头、透镜和激光器需要精确对准，以产生有用的对焦图像。Coop需要考虑的是怎么排除微小的变化（如金属的热膨胀）对对焦的影响。Coop指出，严格确保光学元件排布的准确性会让后面的工作简单一些。

Coop在准备部件时，会尽可能多地使用现成的零件制造显微镜，或者重复使用以前的零件。但是每台显微镜都至少有一些定制的部件，因此Coop必须自己去机器车间设计，甚至制造自己需要的部件。

例如，Keller设计的最新的显微镜的样品室具有端口，可方便四个物镜浸入到样本所在的液体介质中。但这样，要确保镜头被严格密封，防止液体浸入，同时还要保证每个镜头都可以独立移动。另外，由于物镜之间的距离非常近，只有100微米的间隙，同时尺寸和形状各不相同，所以Coop必须调整样品室和密封，以适应各种可能的组合。他估计每个样品室的设计和制作需要两到三天时间，花费在800美元到1000美元之间。

一旦光学和机械工程师完成了原型组装，软件开发人员和计算机科学家便会加入，开发软件，以确保这些部件能够正常工作，并能够生成可用的图像。许多显微镜制造商使用名为LabVIEW的商业软件包来控制他们的显微镜。但据珍利亚研究员园区的程序员Daniel Milkie表示，当机器变得更加先进时，有时需要定制解决方案。

Milkie表示，他们之所以设计新的工具和新型显微镜，其实是在突破硬件能力的极限，因此他们需要有专门的软件来获得最大的性能。该诀窍在于确保软件具有足够的灵活性，能够快速调整以满足新的要求，如更多的检测器。鉴于此，Milkie选择将代码模块化，这意味着软件很容易整合新的元素，而不必从头开始。

但是，Milkie指出，软件方面最大的挑战是如何处理显微镜产生的大量数据。高速摄像机每秒可以产生千兆字节的数据，有些机器可以同时运行多台摄像机。例如Betzig实验室每年可以生成50-100兆兆字节的数据。既然有这么大量的数据生成，就需要一个解决方案。

Milkie的成品看起来一点都不像传统的显微镜。所有部件——镜子、镜头、激光器、照相机和样品室——都被连接到重量为几吨的桌子上的各种支柱和夹具上，以防止显微镜受到振动的影响。Legant表示，这就像一个精致的乐高套件。

Keller估计，从头开始制造显微镜至少需要一年，但如果团队可以回收利用前一代仪器的零件和软件，则可以减少这个时间。而且由于设计需要越来越高级的定制，开发成本只会越来越高。Keller在2005年构建DSLM的成本约为5万美元，而后来的机器需要10万到20万美元。他在2015年的最新版本——各向同性多视图显微镜（isotropic multiview microscope）——成本高达100万美元。Keller感慨，花5万美金打造一个高级显微镜的日子一去不复返了。

其它需要考虑的因素

定制显微镜的使用也很复杂，因为通常用户需要根据每个实验，手动更改大量设置和校准——这是商业制造商极力避免的。不过Waterman指出，这不应该是一个障碍。这是你在显微镜入门课程中应该学习的基础知识。

已发表的、设计新显微镜系统的研究通常会介绍整个计划和零件清单。针对那些想要DIY的人，珍利亚研究园区可以免费在线提供显微镜的计划和软件，并为搭建过程提供帮助。 Legant表示，现有耗时近20小时的视频，指引用户如何组装和对齐零件。事实上，还有很多机构提供类似的免费资源。例如，美国国家生物医学成像研究所（US National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering Section on High Resolution Optical Imaging）生物物理学家Hari Shroff提供的diSPIM.org网站、马普分子细胞生物学和遗传学研究所（Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics）Pavel Tomancak发育生物学实验室建立的OpenSPIM.org网站，以及西班牙巴塞罗那光子科学研究所（Institute of Photonic Sciences）的Emilio Gualda负责的OpenSpinMicroscopy都提供了免费的各种光学显微镜配置计划。

但是，尽管基于已有计划构建显微镜要比从头开始设计更简单，但仍需用户具备光学、机械学、电子学、计算机程序设计和生物学方面的知识。Gualda指出，DIY显微镜最大的优势就是价格。OpenSpinMicroscopy提供的选择性平面照明显微镜（selective-plane illumination microscope）的商业版本价格约为20万美元。Gualda估计，使用他的开源软件和Arduino控制器等价格低廉的硬件，研究人员只需要5万美元便可搭建同样高质量的仪器了，其中大部分成本来自激光器和相机。而且你可以根据自己的需求定制显微镜。

用户可以从一些网上论坛上得到建议和交易提示。根据哈佛医学院（Harvard Medical School）的分子生物学家Srigokul Upadhyayula的说法，2014年，他与Legant合作建立了第一个栅格激光层照显微镜（lattice light-sheet microscope）。这种合作代表了科学家工作方式的一大变化。这种情况是这个领域很少见的——过去大家都倾向于孤军作战。

Legant现在准备在北卡罗来纳大学（University of North Carolina）教堂山分校建立自己的实验室。他打算继续细胞生物学和显微镜设计的工作。他的第一个项目将是重新审视细胞如何移动的问题。他表示，他们最新的显微镜已经解决了技术问题——他们还没有机会将它应用于这个特定问题。现在，Legant创造了完成这项工作所需要的工具，他可能终于会得到他多年来追求的答案。

原文检索：
Brian Owens. (2017)The microscope makers. Nature, 551: 659-662. 
张洁/编译