结合信使
在高分辨率下，使结合于特异蛋白质的RNA在转录组范围分离的一项新技术揭示出RNA结合蛋白与相应RNA结合的部位。
细胞内RNA转录从不单独进行。特别是，RNA结合蛋白（RBP）和含有miRNA的核糖核蛋白复合体以序列依赖方式结合mRNA，在转录后调节基因表达上扮演了重要角色。数以百计的这些RBP和含有miRNA的核糖核蛋白复合体调节着细胞内mRNA的成熟、转运、编辑和翻译，但是仍缺乏精确识别体内这些分子复合体与mRNA结合部位的技术。
在活细胞体内，已知紫外线辐射可以共价交联RNA与RNA结合蛋白复合体。在一个叫做交联免疫沉淀反应（CLIP）的方法中，活细胞被暴露在紫外线下，以冻结RNA蛋白的相互作用，并且用免疫沉淀反应令感兴趣的蛋白以及与它们相关的RNA一起分离。反转录、交联RNA的高通流量测序导致一组序列读取，代表在细胞内与特殊RNA结合复合体联结的RNA序列。
但这个方法有一定局限性。用254-nm紫外线进行光致交联，正如CLIP中所做那样，是相对无效的过程，它会使从背景中分离信号成为难题。交联RNA与非交联RNA的生化分离是一个高要求的过程，更需要使用来自基因敲除生物的材料、计算模型或者期待位点或基序的过滤，来抗击固有干扰。
为解决这些问题，出现了新一代高通流量RNA交联、光敏核糖核苷加强的CLIP（PAR-CLIP），它们由Rockefeller大学的Thomas Tuschl小组与Basel大学生物中心的Mihaela Zavolan合作开发。PAR-CLIP引进并有效应用光敏核苷，以及与RNA合并的无毒交联。在这个方法中，细胞在4-硫尿核苷（4SU）中生长，并且用365-nm紫外线来交联4SU取代的RNA，这比用254-nm紫外线来交联未被取代的RNA更加安全和有效。
这项技术的真实进步来源于一个偶然发现：在反转录中，交联核苷引起一个特异的碱基改变，在RNA中蛋白质复合体的初始位点留下了永久的标记。因为反转录酶在交联4SU碱基对面错误掺入鸟嘌呤，在被测序的cDNA中，对胸腺嘧啶到胞嘧啶的转换评分为精确描述RNA结合蛋白的结合位点打开了一扇门，并且它使得真正的交联RNA序列从干扰中分离出来。
Tuschl等人进行了对PAR-CLIP能量的广泛例证，描述了转录组范围内13个RBP的结合位点，其中7个蛋白质涉及到微RNA定靶。瞄准带有T到C转换标志的序列，作者为RBP如胰岛素样生长因子-2定义了结合基序，并为微RNA确定了过去未知的靶标。
这些数据集通过证实已知的结合配体来确证该项技术的强健，也提供了大量对RNA相互反应的新描述。“现在是要努力将所有数据库排列优先级”，Tuschl说，“我们想知道人类的这些结合位点是否具有遗传变异，以及它们中的一些是否导致了遗传疾病，这涉及到一个RNA结合蛋白的缺失，比如脆性X综合征或家族性肌萎缩性侧索硬化。”
PAR-CLIP的前景光明，它为实验提供了新的、富有想象力的可能，而这些实验将使科学离阐明神秘的基因调节更进一步。
原文检索：Erika Pastrana. (2010) Bound to the mesenger. Nature Methods, 7(6):422-423.
姚宇亮/编译