抗流感药物作用的宿主细胞靶点
人体细胞高通量RNAi筛选技术让我们又一次看到了攻克流感病毒的新希望。
季节性流感每年都会造成全球数十万人死亡，而高致死率的全球流感疫情大爆发更是时刻威胁着人类的安全。最近在《细胞》（Cell）杂志上发表的两篇论文和在《自然》（Nature）杂志上发表的两篇论文分别介绍了最近在抗流感药物研究方面取得的重大进展。这些研究新发现的数百个人类基因都能参与到流感病毒的复制过程当中，这些基因极有可能成为新型抗流感病毒药物的作用靶点。
流感病毒与绝大多数哺乳动物病毒都一样，能够充分利用宿主细胞的各种“资源”完成病毒自身的复制，同时还能抑制宿主的抗病毒免疫反应。如果能够检测出病毒利用了多少种宿主细胞因子，我们可能会惊奇地发现这个数量要远远超过流感病毒本身所能编码的蛋白数量，流感病毒只能编码11种蛋白质。为了确切地找出参与到流感病毒复制过程的人体细胞因子，上述四个科研小组利用RNAi干扰技术开展了深入的研究。他们将一系列的siRNA转染到人体细胞当中，沉默掉了大部分的宿主细胞基因，然后分别检测每一个宿主基因被抑制之后给流感病毒的复制造成的影响。在得到了初步结果之后，科研人员会进而搜索蛋白间相互作用数据库，看看是哪些宿主细胞信号通路参与到了流感病毒复制或者机体的抗流感病毒免疫反应当中。
我们以前也曾经用过类似的高通量siRNA筛选技术来研究有哪些人体宿主基因与HIV病毒、丙型肝炎病毒（hepatitis C）以及西尼罗河病毒（West Nile virus）感染相关。不过在流感病毒研究领域，该技术只被用来对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）细胞进行过筛查（表1）。在黑腹果蝇细胞研究当中所发现的110个细胞因子对于流感病毒感染人体具有多么重大的意义我们目前还不清楚。这是因为黑腹果蝇并不是流感病毒的天然宿主，因此科研人员进行研究时使用的是经过改造的流感病毒。另外，黑腹果蝇也不能表达所有流感病毒组装和获得感染力所需要的细胞因子。
表1 借助高通量siRNA筛选方法检出的与流感病毒感染和复制相关的宿主细胞因子
我们在本文开头提到的那四项研究成果则完全不同，这四项研究的成果意义重大，他们发现了一些新的细胞因子和信号通路，这些因子和通路几乎涉及流感病毒生活史的每一个阶段（图1）。这些阶段大体上可分为早期阶段和晚期阶段。其中早期阶段包括最开始流感病毒与宿主细胞表面的相应受体粘附（attachment）；然后病毒通过细胞胞吞作用（endocytosis）进入宿主细胞；继而病毒包膜与内体小泡（endosomal）融合、病毒脱颗粒；病毒基因组转运进入宿主细胞核内开始转录及复制等步骤。晚期阶段包括病毒核糖核蛋白复合体及RNA移出宿主细胞胞核进入胞质；在宿主细胞胞质中进行病毒蛋白翻译和病毒颗粒组装以及最终新生的子代病毒颗粒从宿主细胞中释放等步骤。
Brass等人使用荧光显微镜对流感病毒包膜上的血凝素（hemagglutinin）糖蛋白进行了计数，用这种方法来判断A/PR/8/34（PR8）流感病毒的感染情况。他们使用骨肉瘤（osteosarcoma）细胞作为宿主细胞来进行siRNA筛查研究，结果发现了312个人体基因与PR8流感病毒感染有关，其中有些基因与易感性有关，有些基因与流感病毒感染抵抗有关。值得一提的是，Brass等人还发现干扰素能够介导一种跨膜蛋白表达，从而抑制流感病毒复制周期当中的早期步骤。
图1 抗病毒药物针对流感病毒复制周期各个阶段发挥作用时所针对的细胞靶点简介。图中绿色部分表示的是甲型流感病毒的复制周期。红色部分显示的是经siRNA筛查之后发现的对于流感病毒完成复制至关重要的细胞信号通路。甲型流感病毒的血凝素能够与宿主细胞表面的唾液酸糖蛋白受体相结合，然后通过该受体介导的胞吞作用将病毒移入胞内。胞吞内体小泡入胞之后被酸化，通过改变血凝素的构象从而让病毒包膜与宿主细胞胞膜融合，病毒的核糖核蛋白体（即图中深蓝色所示）才得以进入胞质当中。病毒RNA进入宿主细胞胞核之后开始转录生成mRNA，然后依靠病毒自身的依赖RNA的RNA聚合酶复合体来进行复制。新合成的病毒核糖核蛋白体被转运出胞核，经过组装之后，成熟的子代病毒通过出芽方式被释放出来。目前，只有针对流感病毒的M2离子通道蛋白和神经氨酸酶蛋白这两个作用靶点的抗流感病毒药物通过了美国FDA的审批，获准上市。金刚烷胺类药物，比如金刚烷胺和金刚乙胺能够阻断M2蛋白的作用，抑制流感病毒脱壳。扎那米韦和奥塞米韦类药物则主要针对神经氨酸酶发挥作用，阻止子代病毒释放。
König等人使用的则是一种重组流感病毒——A/WSN/33（WSN）流感病毒。该病毒基因组里编码血凝素的区域被替换成了萤光素酶报告基因。由于缺少了有功能的血凝素蛋白，因此只能筛查出与流感病毒复制早期阶段步骤（病毒侵入、脱壳以及病毒基因组转运入核等）相关的细胞因子和与病毒RNA转录和翻译过程有关的细胞因子。不过，对病毒复制的晚期阶段，比如病毒粒子组装、出芽和释放等步骤就无法开展研究了。König等人用这种方法发现了295个宿主细胞基因，用siRNA抑制掉这些基因的表达之后能够明显抑制病毒荧光素酶报告基因的表达，如果抑制掉其中219种基因的表达能够抑制WSN病毒的多重生长复制。被发现的这295个宿主细胞基因当中有一些已经被证实与造成2009年全球流感大疫情的H1N1流感病毒的复制相关。另外，König等人还发现针对其中一些因子，比如ATP酶和钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶2β（calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2β）等的小分子抑制剂能够抑制流感病毒的复制。
Karlas等人使用的是一种两步法的方法。他们首先用一个siRNA文库转染被WSN流感病毒感染的A549细胞，然后再用免疫染色的方法检测病毒核蛋白的表达情况，以此来判断病毒的感染情况。第二步是收集这种A549细胞的培养上清，然后用这种上清与一种293T细胞（该细胞含有一个可诱导的流感病毒特异性的荧光素酶报告基因）进行孵育。Karlas等人用这种方法发现了有287种人体基因能够影响WSN病毒的复制。随后，他们又进一步证实了这些基因当中的绝大部分也都能够影响到其它各种类型流感病毒的复制，包括造成2009年流感大流行的那株H1N1流感病毒，因为使用siRNA抑制掉这些基因的表达之后，流感病毒的滴度会明显降低。此处需要重点强调的是Karlas等人在p27基因敲除的小鼠体内进行了实验，用体内试验的数据证实了p27基因对于流感病毒复制的重要意义。
Shapira小组则另辟蹊径，没有使用这种荧光检测的方法，而是使用了一种将酵母双杂交和全基因组芯片检测方法相结合的策略，绘制出了一幅宿主细胞与流感病毒之间相互作用、相互调控的关系图谱。他们利用PR8流感病毒发现了1745个候选宿主细胞基因。随后他们又用siRNA方法对这1745个候选基因的作用进行了逐一验证。
尽管我们利用这种高通量的siRNA筛选技术获得了大量的候选人体宿主细胞基因，可以用分子生物学方法和病毒学方法对它们进行更加深入的研究，但是不可否认，这种高通量的siRNA筛选技术也是有其固有弊端的。首先，因为siRNA一次只能抑制掉一个基因的表达，因此无法发现基因间的协同作用。其次，这种方法也不能发现还未被注释的基因以及那些虽然对于病毒复制非常重要，但是对于宿主细胞同样重要（可能具有毒性或者是致死性的）的基因。最后，上述所有这些通过siRNA方法获得的实验结果都与实验条件和筛选的读值非常相关。实际上，虽然上面介绍的这5项研究当中的每一项研究其目的都是一样的，但是他们最终得到的实验结果却各不相同，彼此的结果之间发生重合的基因才不到20个，这就已经足以说明问题了。
导致这种情况发生的原因之一可能是因为各个实验组使用的细胞系不同，或者是因为实验设计以及使用的siRNA文库不同导致的（具体情况详见表1）。比如Brass小组使用的是U2OS骨肉瘤细胞系和PR8病毒，König小组和Karlas小组使用的是A549人肺泡上皮细胞系，又分别使用了重组的WSN流感病毒和野生型的WSN流感病毒。每个实验小组控制的siRNA实验条件和流感病毒感染的实验条件也各不相同。比如Brass小组是在病毒感染细胞前72小时就先转染siRNA，然后在病毒感染后12小时再检测病毒的感染效果，而König小组和Karlas小组则是在病毒感染细胞前48小时就先转染siRNA，然后在病毒感染后12小时再检测病毒的感染效果。因此，他们各自实验筛选出来的宿主基因应该是分别影响到病毒感染不同阶段的宿主基因。
上面介绍的这四个科研小组新近发现的这数百个人体宿主细胞因子一经公布，马上就成了药物研发机构的宠儿。因为现有的抗流感病毒药物只是针对了两种流感病毒蛋白靶点，即M2离子通道蛋白和神经氨酸酶蛋白，针对这两个靶点分别研制出了金刚烷胺、金刚乙胺和扎那米韦（商品名“乐感清”）、 奥塞米韦（商品名“达菲”）这两类药物。
不过不幸的是，现在已经出现了对上述两类药物具有抗性的流感病毒，因此，我们急需新型的抗流感病毒药物。我们已经在其它的病毒研究当中成功发现了与这些病毒感染相关的宿主细胞因子，比如与HIV-1病毒感染有关的CCR5复合受体等，这些宿主因子都有一个共性，那就是突变率很低，但是流感病毒却具有非常高的突变率，这也是它非常容易产生耐药性的原因之一。最后还需要特别提醒的一点是，源自各个不同家族的病毒可能都能够与同一宿主细胞因子发生相互作用，但是各自产生的结果却大相径庭。比如CCR5蛋白缺乏是西尼罗河病毒感染的早期表征。虽然我们还不清楚这些通过大规模筛查得到的宿主细胞靶点对于抗流感病毒药物的研发工作究竟能带来多么大的方便，不过毫无疑问，这些发现的确能够帮助我们更进一步了解流感病毒本身，也能够帮助我们更加合理地设计广谱的抗流感病毒药物。
原文检索：
Ji-Young Min & Kanta subbarao. (2010) Cellular targets for influenza drugs. Nature Biotechnology, 28(3):239-240.
YORK/编译