小方法解决大问题
只需要一个简单的办法就能有效纠正双光子荧光显微镜（two-photon fluorescence microscopy）的成像变形问题，能够在处理厚度不均一的样品时也能获得理想的图像。
我们该如何衡量引起图像扭曲的光学缺陷（optical imperfections），又该如何解决这些问题呢？这是困扰众多研究领域的重大问题，上至天文学研究领域里对巨大天体结构的成像问题，小至高分辨率显微镜才能分辨的最小结构的成像。我们曾经发明过很多麻烦的办法试图对成像系统的成像效果进行评价，看看各种成像系统的成像效果离最佳效果到底差多少。正是这种不断的努力才积累了大量的知识，我们才能不断地对各种光学系统进行精细的调整，不断纠正各种光学偏差，获得了上至银河，下至细胞亚结构的完美图像。不过看过Ji等人的工作之后我们惊奇地发现，他们怎么能够用这么简单的办法就能完美解决双光子荧光显微镜对深部组织的成像问题呢？
长久以来，对深部组织的成像一直都受到雷莱散射（Rayleigh scattering）现象的困扰。光线中波长越短的光线（蓝光）发生雷莱散射的现象越严重，这也正是为什么白天的天空是蓝色的原因，同时在太阳升起和落山时，由于光线经过大气层的路程较长，波长较短的蓝光大部分都被散射掉了，因此天空呈现红色（波长较长的红光，发生散射的较少）的原因。
双光子荧光显微镜使用波长很长的红外光作为光源，因此能有效地降低散射作用的干扰。红外光相比可见光的散射作用要弱得多，比较容易穿透组织样品，获得更深层次的图像。双光子激发（two-photon excitation）的特点又保证了该显微镜只有很小绕射极限（diffraction-limited）的聚焦体积（focal volume），只有这个体积之内的荧光分子才能被激发，发射出可见光。这种三维红外激发体积能以光栅扫描的方式扫描组织样品。比如用双光子荧光显微镜成像时会对目标区域进行逐层扫描，搜集比如1000×1000个单个的发光位置上的荧光信号，然后根据这些信息组合形成图像。
由于在每一个发光位置我们只需要使用空间上延展的探测器（spatially extended detector）搜集组织发射的荧光，而不需要对荧光进行成像，因此能确保忽略掉引起轻微空间误差的光学像差（optical aberrations）。对于本文所介绍的双光子荧光显微镜来说最重要的就是了解红外光的偏差并尽力纠正这种偏差，实际上也就是激发光点的亮度和大小决定了双光子荧光显微镜的成像质量。那么究竟是什么能决定激发光点的亮度和大小呢？
生物材料不仅包括具有雷莱散射性质的分子和小粒子，也包括较厚的组织，这些组织中包括粗糙的光学不均一物质，而这些物质又偏偏位于双光子荧光显微镜观察部位的表层，因此会造成光线发生讨厌的折射或者弯曲。另外生物材料的光密度或者折射指数经常会与我们所预想的有所差距，但是我们在选择物镜时却是根据我们的预计来选择的。还有很多其它同样重要的影响因素也会影响到最终的成像结果，比如显微镜的光路也并非能够完全像三点成一线那样排列整齐；盖玻片的厚度或者实验温度可能也不能与预计的达成一致等等。
要得到完美的聚焦必须让所有的光线都汇聚到焦点位置。为此设计了一个专门的物镜，如图1a所示，该物镜能够让所有的入射光线在物镜表面发生折射，不过这种折射光线通常都会被物镜和焦点之间的物质所影响，让光线发生我们无法预料的弯曲，这样就会影响到聚焦的质量，同时也会降低成像质量。
Full aperture：完整光圈；Subaperture：亚（部分）光圈；Ray：光线；Aperture plane：光圈平面；Lateral：横向的；Axial：纵向的；Plane of focus：聚焦平面；SLM：空间光线调制器
图1 光线偏差导致亚光圈光线聚焦也出现了偏移。（a）完美的聚焦情况。理想的光束和均一性的观察样品。在光圈平面的光线均匀的球状聚集到聚焦平面的一个焦点上；（b）当光线通过光圈中部分区域时会在聚焦时出现不均一性偏移。光线1和光线2各自在聚焦平面横向方向上的不同部位聚集。经过后续的扫描，这些光线会形成彼此偏离的图像；（c）弄清楚每个亚光圈光线彼此之间的偏离和相位偏差之后就能利用像素化的空间光线调制器重新获得完美的聚焦效果。
在对一个样品进行成像时如果我们能够知道每一条光线在聚焦时到底离焦点位置发生了多少偏差，那么就能够纠正这种偏差，得到近乎完美的图像。
如图1b所示，在聚焦平面，另一条发生了偏差的光线（即图中的光线2）会在稍稍偏离焦点的位置照射样品，而没有发生偏差的光线（即图中的光线1）则会在正常焦点位置照射样品。当只有部分光圈的入射光，比如图1b中所示的部分光圈2（当然也只利用了部分的物镜），用来扫描样品进行成像时，所得到的图像会偏离它正常的位置。现在，Ji等人利用了这种图像移位现象来测量光线的偏离量，这样就无需像以前那样先得通过几个不同的部分光圈图像弄清楚样品的结构信息。现在利用相关图像的相应移位信息就能了解我们所需要的每一条光线的偏离信息。
但是就算我们根据上述信息预先调整了入射光的角度，校正了聚焦时出现的偏差，我们仍然无法得到满意的聚焦效果。这些入射光线仍然需要进行建设性的调整。换句话来说，Ji等人还需要确保所有的光线都必须以同一相位汇聚到焦点位置，这样才能得到满意的聚焦效果，如图1c所示。幸运的是，我们可以同时采集每一个部分光圈的图像和参考光圈（比如图1b中的光线1）的图像，然后分析这些图像了解到获得满意聚焦效果所需要的信息，也可以借助计算机的帮助获取这些信息。
在逐个获取每一个部分光圈的图像并对它们进行分析测量之后，Ji等人终于得到了他们所需要的信息。但是就算有了这些信息，他们又该如何改变每一条入射光的角度（方向）和相位呢？
Ji等人并没有采用在天文望远镜中常用的可变形镜片（deformable mirror），而是使用了一种像素化的（pixelated）空间光线调制器（spatial light modulator, SLM）来控制每一个部分光圈里入射光线的角度和相位（图1c）。他们采用的这种空间光线调制器是一种液态晶体设备，类似于投影仪中使用的那种设备。这种空间光线调制器具有1,920 × 1,080个单元，能够精确地控制每一条光线的相位。Ji等人将这种空间光线调制器放置在了光源和物镜之间，并利用它对入射光进行了分配，进入各个亚光圈当中，然后利用空间光线调制器中的相位坡道（phase ramp）对每一条入射光的方向进行调控，这样就协调了入射光的相位和方向，得到了满意的聚焦效果。借助这种技术，实现了对深部组织的完美成像。上面介绍的这种简单方法（即比对通过不同亚光圈得到的图像之间的差别）不仅让Ji等人在试验研究当中能够准确地测量出光线的偏差量并进行纠正，也能在对深部脑组织中被荧光标记的神经元进行成像的实际操作时得到满意的结果。
虽然上述方法在观察较厚的、非均一性质的组织样品时能得到近乎完美的图像，但还是存在一些问题。比如这种通过几个亚光圈实现的聚焦会让焦点变大，尤其是在入射光的轴向上会明显扩大（图1a、b）。更重要的是，这种轴向延伸现象还会在其它方向上出现（如图1b中的光线2）。因此，每一个亚光圈图像实际上采集的都是各个不同斜位投照方向（oblique projection direction）上的信息，如图1b中垂直向下的光线1方向和斜向的光线2方向。如果最有用的信息来自理论上标准焦点平面偏上或偏下的部位，那么我们上面介绍的校正方法还能起到纠正作用，但是会在聚焦平面上出现一个不希望出现的轴向偏移。这种偏移可以通过计算机技术来帮助避免，但针对典型样品而言，似乎无需进行这一处理。
不过这种方式由于只能使用光圈的部分区域，因此在成像时能够选择的亚光圈数有限，而且因为没有完全使用整个光圈，所以所得的图像在亮度上会有所损失。
还有一个问题就是，现有的方法假定在整个成像区域里所有的偏差都是一样的，但这个假定很有可能是错的。如果真是这种情况，那么只需要个别的修正一下观察样品或者利用能够说明局部偏差现象的图像配准算法（image registration algorithms）程序来分析与亚光圈有关的图像偏差现象就都能达到优质的成像目的。不过这种依赖亚光圈的修正方法需要在进行扫描器件对所使用的空间光线调制器进行随时调整。
如果将上述这种方法应用到其它光学显微镜领域效果应该也不错。比如可以使用与之相关的方法利用传统的荧光显微镜的探测功能而不是照射功能来观察较薄的样品。或者使用Levoy等人介绍的亮视野显微镜（light-field microscopy）就能同时得到相关的图像，而不需要分别使用各个亚光圈来进行成像。此时在图像平面放置了一个微镜阵列（microlens array），每个微镜都会形成一个只有几个像素的小图像，这个微镜阵列能为光圈平面产生数以万计的小图像。然后可以很方便地将这些小图像数据重建形成我们所需要的亚光圈图像。Levoy等人最初将这种技术用于DSA体层摄影数字减影血管造影三维重构，但这种技术同样也可以用来检测荧光成像中的图像偏差问题。最近发表的一篇论文介绍了他们对透射光学显微镜（transmission light microscope）的光线偏差进行的测量工作，他们使用的就是针对已知光源结构，基于与光圈有关的偏差测量方法。不过有了Ji等人发明的方法，我们在使用Levoy等人于2006年发明的方法时就不再需要知道光源的结构了。
按照Ji等人介绍的那种方法，我们需要采集大量的亚光圈图像，这需要耗费大量的时间，尤其是在观察活体标本时更是如此。不过Ji等人也介绍了一种改进办法，用这种办法能同时发现一幅图像中的所有偏差。这个方法是有意识地让光线通过每一个亚光圈时都以一个相对大一些的倾斜角通过，这样每一个亚光圈的图像就会在不同的空间方向上呈现出来。利用这种方法只需要采集一幅图像就能包含好几幅偏差图像的信息，然后通过自相关技术就能精确地测量出“每一幅”图像之间的相对偏差信息。不过这种方法有一个明显的不足就是它需要非常强大的激光光源。
正如Ji等人所指出的，对于受激发射衰减显微镜（stimulated emission depletion）或非线性结构照明显微镜（nonlinear structured illumination microscopy）等高分辨率显微镜来说，检测并控制图像偏差至关重要。对于这些显微镜来说，对光源进行精细的控制是第一位的，而不能对图形进行修正则是非常严重的不足，哪怕对于较薄的观察样品来说也是如此。不过有了这种亚光圈方法，我们现在就能解决上述问题了，而且还能将这种方法推广至其它领域，比如天文观察、眼科学，甚至是浑浊介质中的成像问题等等。
原文出处：
Rainer Heintzmann. (2010) Correcting distorted optics: back to the basics. Nature Methods, 7 (2):108-110.
筱玥/编译