瞬时测序新技术
一种能对数千个聚合酶进行同时监测的新系统使得实时的、准确的多重DNA测序成为可能。
一直以来，研究人员都没能开发出一种试剂，令其能够在速度和效率上与天然DNA聚合酶相媲美，也没能开发出一套系统，令其能充分利用DNA聚合酶的高效特性进行研究工作。尽管开发这种系统将面临巨大的技术挑战，但还是值得一试的。事实上，只要能在不影响聚合酶活性的前提下直接对每一个聚合酶进行监测就可以了。
早在10年前，美国康奈尔大学（Cornell University）的研究生Steve Turner和Jonas Korlach就已经为解决这一难题而做出不断努力。Korlach与Turner合作是希望能借助后者在纳米结构技术方面的优势共同开发出一种能对单个聚合酶进行成像的系统。
Korlach回忆道：“起初，我感兴趣的是，如何能够实时观察这些细胞内的“小机器”（聚合酶分子），并研究它们的动力学情况。不过很快，我们意识到如果能观察每一个聚合酶分子，并且能确定究竟是哪一个碱基分子被聚合酶掺入了新生的DNA链中，那么我们将能够发明一种新的、功能强大的DNA测序技术。”
现在，Korlach和Turner创办了一家名为Pacific Biosciences的公司，并且已经将他们的想法转变成为现实产品。他们的新测序仪使用了名为零模式波导（zero-mode waveguide，ZMW）的纳米结构。这些ZMW结构构成了一个个小孔，每一个单独的聚合酶分子都以特定的方向被固定在这些细小的孔内，这样就非常容易借助适当浓度的荧光标记核苷酸对它们进行成像观察，而且成像的背景噪声非常低。
图片说明：每一个聚合酶分子都被固定在一个铝制ZMW小孔中，当荧光标记的核苷酸分子与聚合酶分子结合时就会发出一次荧光信号。
图片来源：Pacific Biosciences
Korlach与Turner还有一项重大发明。鉴于传统的核苷酸标记方法通常都会影响聚合酶的活性或者造成聚会反应提前终止，因此，Korlach和Turner就开发出一种新型核苷酸标记方法，即在核苷酸的末位磷酸基上进行标记，这样，一旦核苷酸被掺入新生DNA链中，标记基团就会自动脱落。
测序仪中，每一个ZMW小孔内都含有一个聚合酶分子，都能依照模板合成一条完整的互补链。由于聚合酶分子每被掺入一个荧光标记的核苷酸分子都会发出一次短暂的荧光信号，这些荧光信号会被仪器记录下来。这样，每一个ZMW小孔内的整个反应过程都会被特殊设计的多重共聚焦成像系统（multiplexed confocal imaging instrument）实时监控并记录下来。
尽管他们发明的这种新测序仪还面临着许多难以克服的技术难题，但它仍然称得上是一个功能非常强大的测序仪。这台测序仪能以2~4个碱基/每秒的测序速度对环状或线状模板进行实时的精确测序。虽然仪器的每一次“读数”都有出现错误的可能，但由于同时进行了多次测序，所以能得到准确率非常高的结果。Korlach他们也不断对仪器进行改进。虽然他们在论文中指出，重复测序15次能达到99.3%重复符合率，但是实际上，现在仅需重复测序11次就能达到99.97%的重复符合率了。
尤其值得注意的是，Turner他们开发的这款测序仪比目前市面上的其它测序仪能测序的片段长度都要长，达到了4000个碱基。
Turner和Korlach预计，他们将于2010年上市的这款测序仪将极大地改进基因测序的工作流程，并且他们相信，更新一代的测序仪将具有更多更强大的功能。Turner指出，如果你能在半小时之内对一个样品进行测序，那么就能和芯片测序、定量PCR测序或其它测序方法媲美了。
他们最终希望能用计算机来完成这一切工作。
YORK/编译
原文检索
Eid, J. et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science 323, 133–138 (2009).