研究活动小鼠脑部机能的新技术
一种新型的便携式纤维光学落射荧光显微镜的诞生，使得在细胞分辨率水平对自由活动的小鼠的脑部机能进行实时成像成为可能。
通过电生理记录仪和磁共振机能成像技术已经发现，个体行为和脑部机能存在着惊人的联系。然而到目前为止，神经学家尚未能很清楚地解释由神经元网络中指导个体行为的潜在的动态活动模式，因为这需要保证动物活动自由、行为正常，从而能在细胞水平观察其神经活动。本期《自然-方法学》杂志（Nature Methods）上的一篇报道证实，具有高度时空分辨率的纤维光学成像技术非常适合于测量自由活动小鼠中单个神经细胞的活动情况[1]。
随着新型荧光标记物和显微检查技术的出现，光学成像技术已经代替电生理方法成为在时间和空间层面揭示脑部功能的新手段。尤其是具有体内高分辨率的双光子激发显微成像技术的开发，对于在细胞和亚细胞水平揭示脑部功能做出了巨大贡献[2]。但是目前我们所掌握的绝大部分主要还来源于对麻醉的或头部活动受限的动物的脑部成像，对于自由活动的动物进行光学记录还存在着极大挑战。
研究人员主要采用两种方法对清醒的活体动物进行成像。第一种方法名为CT高分辨率电子计算机X射线断层成像术。在最近的一项研究中，研究人员让头部活动受限的小鼠在气承式泡沫聚苯乙烯球上跑动，并采用上述技术对其脑部活动进行了成像[3]。另外一种方法则是在动物肩背部安装小型显微镜。采用柔韧的光纤是保证这种方法可行性的关键，因为研究人员可以通过它们在头盔式前端显微镜与远端光源及光电检测器之间自由传送光线。
自从证实了利用便携式双光子显微镜能够获得活动动物的毛细血管高分辨率图像之后4，各种以单光子或双光子激发为基础的，同时包括宽视野照明系统及激光扫描仪的简易成像仪陆续出现[5]。但是到目前为止，还没有一个装置能够对自由活动的动物进行单细胞活动测定。
最近，Flusberg等人[1]设计了一种由单光子激发的小型落射荧光显微镜，实现了在单细胞分辨率水平上的成像（图1 a）。这种显微镜设计原理很简单，主要是基于图像需要通过排列整齐的光纤束传输这一原则（图1 b）。这些光导纤维束含有成千上万的光芯，而它们又可被细分为直径只有10微米的组件。光纤束的远端能够直接连接到脑区表面，而另一端则接入摄像机成像。这种方法之前一直用来结合快速电压敏感性染料，对于自由活动动物的感觉形成过程进行成像[6]，但是这种空间分辨率还远不足以对单个细胞成像。为了达到微米级分辨率以分辨单个细胞，Flusberg等人利用细小的杆状透镜增加了一个额外的图像传输阶段，以对成像进行适当放大（图1 b）。他们所展示的小型化显微镜只有樱桃般大小，重仅1.1克，因而方便小鼠携带。另外他们还置入一个马达式聚焦透镜，可以对焦平面进行远距离调节。通过采用快速电荷耦合器件（charge-coupled device, CCD），可以令1/4~1/3毫米影像野中的图像采集频率达到100赫兹。
Flusberg等人应用这一成像技术解决了对神经学家来说两个最重要的根本问题，并证实了该方法具有潜在的应用价值[1]。首先，他们向血管中注入荧光标记物，追踪未被标记的红细胞以测量血流速度[7]。通过对大脑新皮质和海马区（将前透镜通过植入的导管插入海马区）微脉管系统血流成像，他们发现血管直径与血液流速之间存在正相关，并依此绘制了活体动物的脑部血流速度图像。由于血流改变会造成磁共振机能成像出现信号差异，采用微脉管系统的高分辨成像技术也许对于深入理解不同脑区活动时的血流动力学改变有极大帮助。
这项新研究的另一个主要成就在于它是第一次在单细胞分辨率水平上对自由活动小鼠的小脑活动进行成像。通过向小鼠小脑神经元加入钙敏感性荧光染料，能够更加直观地观察小脑皮质的神经活动[8]。在小脑表面上看起来，浦氏细胞树突分枝在同一平面的高序排列就像是细小的条纹，很容易进行表面荧光成像[9,10]。通过解析单个相邻的浦氏神经元的条纹状激活信号，Flusberg等人[1]认为，机体活动时浦氏神经元更为活跃，而安静状态的浦氏神经元则会聚集在一起[9]。由于小脑皮质对于运动协调和运动学习至关重要，对活动小鼠浦氏细胞的活动情况进行光导纤维成像将具有重要价值。当然，特定的激活模式和行为之间的关联还有待阐明。
上述这些关于血流和神经元活动的在细胞水平上获得的高速影像，在小鼠活动过程中都是相当稳定的。这也许归功于显像装置设计相对紧凑、简单，缺少光学部件，这也使得这个装置适应范围较广。与小型扫描装置的不同之处在于，光纤束成像不需要任何可移动的组件，这可能使得它对活动动物的头部存在的运动加速度不甚敏感。光纤束成像的另一个优点在于其时间分辨率仅与摄像速度和信噪比有关。当然，除了这些优点，也存在一些问题有待解决，其中最主要的是单光子激发显微镜可进入脑区的深度有限，并且缺少可用的光学切面。就这一方面来说，采用同等大小的双光子光纤显微镜[10,11]对大脑皮层深部的神经元簇及其细小的树突分枝中的活动进行成像可能具备一定的优势。
随着对头部活动受限动物的成像技术的出现[3]以及光纤成像系统的即将诞生——诸如在这篇报道中提及的对脑区[12]和各亚区[13]进行大面积测量的低分辨率成像系统和具有细胞水平高分辨率的成像系统，神经学家们获得了观察动物特定行为中神经活动模式的有力武器。这些武器预示着令人振奋的时代即将来临！
图1 活动小鼠脑部高分辨率光纤成像
(a)激发光通过光导纤维束在一个方向上传播，发射光由同一路径返回，并经由分色镜反射入摄像机中成像。(b) 小角膜接触镜将荧光标记的脑部细微结构放大并投射到光芯整齐排列的光纤束中，从而小鼠脑部成像传输到摄像机中。从脑部表面看来，在同一平面上被钙敏感性荧光染料标记的神经细胞树突状分支和小脑浦氏细胞呈现出平行的条纹图案。
Kitty/编译
原文检索：www.nature.com
参考文献
1. Flusberg, B.A. et al. Nat. Methods 5, 935–938 (2008).
2. Helmchen, F. & Denk, W. Nat. Methods 2, 932–940 (2005).
3. Dombeck, D.A., Khabbaz, A.N., Collman, F., Adelman, T.L. & Tank, D.W. Neuron 56, 43–57(2007).
4. Helmchen, F., Fee, M.S., Tank, D.W. & Denk, W. Neuron 31, 903–912 (2001).
5. Flusberg, B.A. et al. Nat. Methods 2, 941–950 (2005).
6. Ferezou, I., Bolea, S. & Petersen, C.C.H. Neuron 50, 617–629 (2006).
7. Dirnagl, U., Villringer, A. & Einhaupl, K.M. J. Microsc. 165, 147–157 (1992).
8. Sullivan, M.R., Nimmerjahn, A., Sarkisov, D.V., Helmchen, F. & Wang, S.S. J. Neurophysiol. 94,1636–1644 (2005).
9. Ozden, I., Lee, H.M., Sullivan, M.R. & Wang, S.S. J. Neurophysiol. 100, 495–503 (2008).
10. Engelbrecht, C.J., Johnston, R.S., Seibel, E.J. & Helmchen, F. Opt. Express 16, 5556–5564 (2008).
11. Flusberg, B.A., Jung, J.C., Cocker, E.D., Anderson, E.P. & Schnitzer, M.J. Opt. Lett. 30, 2272–2274 (2005).
12. Adelsberger, H., Garaschuk, O. & Konnerth, A. Nat. Neurosci. 8, 988–990 (2005).
13. Murayama, M., Pérez-Garci, E., Lüscher, H.R. & Larkum, M.E. J. Neurophysiol. 98, 1791-1805 (2007).
关键词：电荷耦合器件Key words：CCD